WB实验步骤详细总结Word文件下载.docx

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1

温度「C）时间（时：

分钟）

5.保存

变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4C保存，点样是取出即可用

WB实验步骤

1.清洗玻璃板：

清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对

齐，以免漏胶。

2.配制分离胶

1）准备：

1ml枪（蓝色枪头），200讪枪（黄色枪头）10讪（白色枪头）

2）10%分离胶的配置：

（用50ml烧杯。

1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）

5.91ml

超纯水

4.95ml

丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效

3.75ml

Ph8.8Tris?

HCL

150M

10%SDS

150

AP（催化剂促凝作用）

9讪

TEMED

混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）

3.灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出

防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止

4.水封

立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响

电泳效果，等待20-30min

5.浓缩胶的配制（5%）

4.13ml

1ml

750M

Ph6.8Tris?

ICL

60m

60M

6讪

6.电泳（电泳液最多使用两次）

1）安装电泳装置

低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔岀防止拔歪）

2）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）

Mark

4讪

（Proternladder）推荐9卩，实际4卩已经足够

样品

8讪

7-10讪均可内参挑齐即可

组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪

3）连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接：

黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳

先调电压至70mV，跑约20min。

（Mark跑开，分出彩带即可）

再调电压至120mV，跑约60min。

（不能跑过下面的玻璃板）

注：

Mark的条带从红色条带往下依次为：

70-55-40-35-20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在

哪L段剪。

用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。

放入装有转移液的皿中浸泡

7.转膜（转移液可用3-4次）

1）剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。

然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）

2）剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上

3）“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、

两层滤纸-胶-膜-两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）

4）安装转膜装置：

黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。

加入转膜液至满（否则仪器无法启动）

5）打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰

转膜成功标志：

胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色

8.圭寸闭

1）配制5%脱脂奶粉：

2.5g脱脂奶粉

［小烧杯中混匀加入皿中

50mlTBST..

2）将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移

液可以重复利用2次）

9.一抗

1）用TBST配，每一格加5mlTBST，再分别加入抗体

抗体的量：

21（Psmad2l）免抗

1:

1000

5讪：

5ml

58（分子量）

500

10讪：

58

Jnk免抗

双带

内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥

5000

1讪：

36

2）膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）

3）4°

C冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）

10.洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。

11.二抗

1）用3%的脱脂奶粉

1.5g的脱脂奶粉[

>

小烧杯中混匀加入皿中

50mlTBST丿

2）每格吸入5ml3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:

5000，即加入1讪

注意：

吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗

3）膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）

12.洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次

13.显影:

U盘

A液，B液（显影液。

4C保存）

所需物品<

200pl枪+枪头（黄）

<

膜（置于皿中）

1）开机后自动预冷，温度降到1-20'

C才可

2）显影液现配现用（A液：

B液=1:

1）

3）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上

4）先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。

5）每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘

试剂配方:

5J3O°

oAcrBic07,5:

丙烯醜胺（Act）

23.1g

甲叉双丙烯®

t胺（Bic）

075£

剖纯水至

100mJ

IRAcr28Jg,加超纯水〔约80ml）,搅拌’待A席帑解后*WBic0.75g.溶解

后定容电100ml,转移至哋庾战扇瓶C100ml）

4:

C避光保存口

6）L5MTrisHCl（pH88）

Tfis（MW12L14）

4543g

200ml

洛解后•用浓盐酸调pH至86室诅保存.

7）LOMTrisHCI（|：

H7,5）

Tris（MWJ21J4）

30.29g

J3纯水

溶解后，用浓盐酸调pH7.5（浓盐检加入休积约161111），牢温恨存。

8）0.5MTrisHC1〔pH&

8）

Tris（MW12144）15.14g

超纯水200nil

潘解后，川浓衣酸调pH至6&

窒常保

9）10%SDS（I.烷基硫隈讷）

SDS10袞

趙纯水100ml

5FC水浴，至禿分ifijW,室隘探存b（如果艮期保疗屮出现沉淀，水浴溶化后・可继续便用）

10）10%AP（过流酸做｝

AP0.1g

超纯水1ml

涪解£

化斑光保存,保#时何为1周.

11）20°

°

TwecnlO

Tween2020ml

超存水80nil

混匀后，4=C保石*

12）10%分离胶<

1块胶）

超纯水3.94ml

30°

4Acr<

Bic；

.33ml

L5MTn^HCl〔pH&

8>

25ml

13%SDS】00卩】

10%AP100pl

TEMED6山

13）1$%分离股（1块胶）

剖纯水23ml

30%Ac「BX5,0ml

15MT11SHC1（pH8.8）2.5ml

14）5%浓缩胶胶）

SO%ActBic

10ml

05MTiisHCl

（pH6.8）

075nil

10%EDS

60llI

10%AP

60jd

6[d

15）电泳液<

1000ml）

甘氨酸

IKSg

Tris

3Q4a

SDS

lg

趙纯水

1000ml

搅徉溶解后备用,应在三天内使用乜

16）转移液（1000ml）

U氨酸

144g

304g

0^Se

匚

超纯木

£

00ml

搅捋溶解后.加

甲醉

混匀.静置20mill后，转移至硬质玻璃柢中，

盖保存*

应在三天内使用口

4,13ml

17）TBST（1000ml）Buffer

8.8g

990ml

NaCJ

搅样洛解Er,加

l.OMTnS'

HCl（pH75）1Cnil

20%TwccnlO236ml

混匀rR移至硬质玻漏瓶中备用，应在三灭内使用口

18）封闭液（5%脱脂奶粉〉

2.5g脱脂奶粉-50nJTEST搅件溶解，现呢先川便用。