基因工程重点总结.docx
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基因工程重点总结
第1章绪论
1、重组DNA技术:
是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术。
因此,供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
4、基因工程的基本操作程序(P7)
(1).从供体生物的基因组中分离获取带目的基因的DNA片段
(2)限制性核酸内切酶将含有外源DNA和载体分子切开
(3)DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上,形成DNA重组分子
(4)将重组DNA分子引入到受体细胞
(5)带有重组体的细胞培养拓增,获得大量的细胞繁殖群体
(6)筛选和坚定转化细胞,获得使外源基因高效稳定表达的记忆工程菌或细胞
(7)将选出的细胞克隆的目的基因进一步演剧分析,并设法使之实现功能蛋白的表达
第二章基因工程的工具酶
一、限制性核酸内切酶P15:
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4—8bp),并由此处切割DNA双链的核酸内切酶
hsdR:
编码限制性核酸内切酶
hsdM:
编码限制性甲基化酶
hsdS:
表达产物协助酶识别特殊的作用位点。
1、粘性末端的意义P
①连接便利
i)不同的DNA双链
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
ii)同一个DNA分子内连接:
通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
②5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等)造成人工粘性末端。
③补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
2、同裂酶:
是不同来源分离出来的不同酶,但具有相同的识别顺序,切割DNA的方式可以相同,也可不同。
如XmaI和SmaI
3、同尾酶:
它们是不同的酶,但切割后可产生相同的粘性末端,因此同尾酶的切割片断之间可以相互连接,这种酶在分子生物学中有较大的价值。
4、远距离裂解酶:
这类酶的识别位点与切割位点不一致,它们在某一核苷酸区域与识别顺序结合,然后滑行到识别顺序以外的另一个位点进行切割。
5、可变酶:
这类酶是II型酶中的一个特例,它们的识别顺序中的1个或几个核苷酸是可变的,并且其识别顺序—般大于6个碱基对。
6、II型限制性核酸内切酶酶解注意事项
①浓缩的酶应该用缓冲溶液稀释,稀释后应尽快用完;
②保存在50%甘油中,-20度条件下;
③酶切反应的时候,最后加酶;
④酶从冰箱中取出后应该放置于冰上或者冰盒上;
⑤酶应该分成小份,避免反复冻融;
⑥取酶要用新的灭菌的吸头,避免污染;
⑦加酶的体积不要超过反应体系的1/10。
7、影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度
蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等
解决方法:
加大酶的用量,1mgDNA用10U酶
加大反应总体积,延长反应时间。
②DNA甲基化程度
③反应条件
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即Staractivity现象。
EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列,但在甘油浓度超过5%,可切割5‘PuPuATPyPy3’
④酶的纯度
⑤酶切反应的温度和时间
大多数的内切酶,最适反应温度为37度,但也有例外,如SmaI为25度。
酶解时间可以通过加大酶量而缩短。
8、限制性内切酶的命名
二、DNA连接酶
1.两种DNA连接酶
(1)大肠杆菌连接酶
需要NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。
(2)T4噬菌体DNA连接酶
以ATP作为辅助因子;不但能连接粘性末端;还能连接齐平末端;RNA:
DNA杂交分子中RNA上的缺口。
2.T4噬菌体RNA连接酶
以ATP作为辅助因子;催化单链DNA或RNA的
5‘-p与3’-OH共价链接
(1)连接条件
1 必须是两条双链DNA。
2 DNA3’端有游离的-OH,5’端有一个磷酸基团(P)。
3 需要能量
动物或噬菌体中:
ATP;大肠杆菌中:
NAD+
4 只能连接相邻核苷酸之间的缺口
3.影响连接反应的因素
(1)DNA末端的浓度
(2)反应温度
(3)ATP浓度
三、常用的DNA聚合酶的特点
1.共同特点
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
2.主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同
3.DNA聚合酶在基因工程中的用途
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I
基本性质:
5’→3’的DNA聚合酶活性;5’→3’的核酸外切酶活性;3’→5’的核酸外切酶活性。
基本用途
缺口前移标记法:
Nicktranslation(切口平移);制备³²P标记的探针。
(2)Klenowfragment
①Klenowfragment的性质
具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。
(失去了5’→3’外切酶活性)。
②基本用途
v3’端补平
补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。
vDNA3’末端标记
在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。
v在cDNA克隆中,用于cDNA第二链的合成。
v双脱氧末端终止法测定DNA序列
(3)T4DNA聚合酶
①基本特性:
a.具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。
b.在无dNTP时,可以从任何3‘-OH端外切
c.在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸暴露时停止
d.在有四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位。
②基本用途
a.补平隐蔽末端;b.DNA3’末端标记
③标记
a.放射性标记
b.非放射性标记
i)生物素标记:
Ø生物素(biotin),又称维生素H、辅酶R
Ø可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。
也可以被生物素连接酶(biotinligase)催化与蛋白质共价结合。
Ø生物素的识别——亲和素:
能与生物素特异结合的蛋白或抗体,常用:
抗生物素蛋白(avidin):
是一种鸡卵清蛋白
链霉抗生物素蛋白(streptavidin):
细菌中avidin的类似物
ii)地高辛标记:
可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等,参入DNA合成过程。
形成地高辛标记的DNA探针。
地高辛的结合物是抗地高辛抗体。
iii)偶联酶及其底物
常用的两种酶:
辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRPO)碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,AP)
酶的作用:
催化一些特殊的反应,反应的过程中发出荧光(或生成有色的产物)。
iv)用非放射性标记的探针检测原理
探针DNA用生物素或地高辛标记,亲和素或地高辛抗体与酶偶联,酶催化一个发光或显色反应,亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。
核酸探针杂交筛选法的缺点是:
只检测是否有外源DNA插入,而不论该DNA是否表达出产物。
(4)T7DNA聚合酶
①从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的,由两个亚基组成:
✓T7基因5编码的大亚基:
有5’→3’的DNA聚合酶和3’→5’的核酸外切酶活性
✓大肠杆菌编码的小亚基:
硫氧还蛋白,增加大亚基对模板的亲和性
②T7DNA聚合酶的特点:
◆持续合成能力强:
一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
◆3’→5’外切酶活性高:
单链和双链都能降解。
◆不受DNA二级结构的影响
③T7DNA聚合酶的用途
✧以大分子量DNA为模板的合成:
如M13
✧进行末端标记:
与T4DNA聚合酶相同
✧补平隐蔽末端:
合成补平3’隐蔽末端;水
解修平3’突出末端。
(5)修饰后的T7DNA聚合酶
①T7DNA聚合酶的化学修饰
去除3’→5’外切酶活性,使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。
②修饰后的T7DNA聚合酶的用途
●Sanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测
序的理想用酶
●标记DNA3’隐蔽末端
●③更有效地补平末端
(6)Taq-DNA聚合酶
Ø具有耐95℃左右高温达30min以上的特性;
Ø催化5’→3’的DNA新链合成,最适温度68~72℃,合成速度1200bases/min;
Ø在合成的DNA链的3’端常多一个“A”;
Ø不具3’→5’的外切酶活性,即无校正功能,大约每合成500个碱基要错配一个;
Ø具微弱的5’→3’的DNA外切酶活性。
(7)pfu聚合酶
v具有耐95℃左右高温达30min以上的特性;
v催化5’→3’的DNA新链合成,最适温度68~72℃,合成速度600bases/min;
v合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A;
v合成的DNA片段长度在2kb以内;
v具3’→5’的外切酶活性,即有校正功能;
v无5’→3’的DNA外切酶活性。
(8)TaqPlusIDNAPolymerase
✓具有耐95℃左右高温达30min以上的特性;
✓催化5’→3’DNA新链合成,68~72℃最适;
✓可合成10-30kb的长DNA片段;
✓合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A;
✓具3’→5’的外切酶活性,有很强的校正功能,
大约每合成1.6x106个碱基要错配一个;
✓具微弱的5’→3’的DNA外切酶活性。
(9)PyrobestDNApolymerase
◆高保真性(HighFidelity)和Pfu等DNA聚合酶相同,Taq的10倍以上。
◆良好的扩增性能,优于Pfu等DNA聚合酶。
◆扩增得到的PCR产物为平滑末端
(10)依赖于RNA的DNA聚合酶
反转录酶的基本特性:
以RNA为模板聚合cDNA链
1 M-MuLV:
鼠源RT,来源于鼠白血病病毒(MoloneyMurineLeukemiaVirus)
最适温度42℃,以RNA、DNA或RNA∶DNA杂分子为模板,需引物,需Mg2+或Mn2+为辅助因子,具有RNaseH活性,特异性地对RNA∶DNA杂分子中的RNA降解
2 禽源RT,来源于鸡成髓细胞增多症病毒(AvianMyeloblastosisvirus)(特点同上)
3 PowerscriptReverseTranscriptase
CLONETECH公司的专利产品,源于M-MuLV的一个点突变。
无RNaseH活性,故合成的cDNA不会因此变短。
具有末端转移酶活性,倾向加3个“C”。
用于合成全长cDNA。
3、核酸酶
1.单链核酸外切酶:
核酸外切酶VII(ExoVII)
大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+
2.双链核酸外切酶:
核酸外切酶III(ExoIII)
大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切
3.双链核酸外切酶:
λ核酸外切酶(λExo)
λ核酸外切酶特异性地从5‘端外切
4.单链核酸内切酶:
S1核酸酶
S1核酸酶基本特性:
降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍;Zn2+必需;最适pH范围为4.0-4.3;需要NaCl10-300mM;降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。
5.Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的基本特性:
A:
来自艾氏交替单胞菌(A.espejiana)
B:
单链内切双链外切的核酸酶:
Bal31核酸酶的基本用途:
诱发DNA突变
四、核酸修饰酶
1.末端脱氧核苷酸转移酶
5’→3’DNA聚合酶活性
①末端转移酶的特性:
✓需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。
✓不需要模板。
✓底物可以是单链DNA是3’—OH突出的双链DNA平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。
✓随机添加的dNTPs,如果只有一种dNTP,就添加上同聚物。
②末端转移酶的用途:
✧同聚物加尾:
给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴,以使它们有效地连接。
✧再生酶切位点:
便于回收克隆片断。
✧非放射性标记DNA片断的3’端:
催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。
(生物素-11-dUTP等)
2.T4多核苷酸激酶P35
①功能:
催化γ磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。
(不论5’-OH端突出与否)
如果ATP的γ磷酸带有32P标记,就会被转移到DNA的5’端。
但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。
②多核苷酸激酶的用途:
◆正向反应(forwardreaction)
◆交换反应标记法
反应混合物中具有超量(γ-32P)ATP和ADP时,
多核苷酸激酶能催化(γ-32P)ATP的-32P与
DNA5’端的磷酸交换。
3.碱性磷酸酶(参见P35)
来源于牛小肠碱性磷酸酶
可催化核酸分子的脱磷作用,使DNA或RNA的5’磷酸变为5’-OH末端
第三章用于基因克隆的载体
载体的功能:
运送外源基因高效转入受体细胞;为外源基因提供复制能力或整合能力;为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
载体应具备的条件:
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性),具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有合适的筛选标记。
一、质粒载体(P42-43)
A:
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子;
B:
质粒常见于原核细菌和真菌中;
C:
绝大多数的质粒是DNA型的;
D:
绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构,即cccDNA;
E:
质粒DNA的分子量范围:
1-300kb。
1.天然质粒的缺陷
(1)分子量大,拷贝数低;
(2)筛选标记不理想。
2.理想载体条件
(1)具有较小的分子质量和较高的拷贝数
(2)具有若干限制性内切酶的单一酶切位点,以满足基因克隆的需要
(3)具有两个以上的选择标记基因
(4)缺失的mob基因
(5)插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达
3.质粒的选择标记及其工作原理
绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记:
氨苄青霉素抗性(Ampr)
卡那霉素抗性(Kanr)
四环素抗性(Tetr)
链霉素抗性(Strr)
氯霉素抗性(Cmlr)
i)氨苄青霉素(Ampicillin,Amp),青霉素的衍生物。
a.抑菌原理,通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死生长的细菌。
b细菌抗性原理:
Ampr基因编码β-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的β-内酰胺环。
ii)氯霉素(chloramphenicol,Cml)
a.抑菌原理:
通过与50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
杀死生长的细菌。
b.细菌抗性原理:
Cmlr编码乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活。
iii)卡那霉素(kanamycin,Kan)
a.杀菌原理:
通过与70S核糖体结合,导致mRNA发生错读。
杀死细菌。
b细菌抗性原理:
Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用。
iv)链霉素(Streptomycin,Str)
a.杀菌原理:
通过与30S核糖体亚基结合,导致mRNA错译。
杀死细菌。
b.细菌抗性原理:
Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰,阻断其与核糖体30S亚基结合作用。
v)四环素(Tetracycline,Tet)
a.抑菌原理:
通过于30S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
杀死生长的细菌。
b.细菌抗性原理:
Tetr编码特异性蛋白质,对细菌的膜结构进行修饰,组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
4.重要的大肠杆菌质粒载体
(1)pBR322:
松弛型复制;氯霉素可扩增;拷贝数50-100/cell;用于基因克隆。
a.元件来源:
①复制起点ori:
pMB1系列(来源于ColE1)的高拷贝型复制起点;
②Ampr基因:
pSP2124质粒的Ampr基因;
③Tetr基因:
pSC101的Tetr基因。
b.选择标记:
氨苄青霉素和四环素抗性
c.pBR322的优点:
①双抗菌素抗性选择标记:
插入失活,分两次先后选择:
没有获得载体的寄主细胞,在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞,在Amp或Tet其中之一中死亡。
②分子小,克隆能力大:
载体越小越好。
>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③高拷贝数:
氯霉素扩增之后,每个细胞可达1000~3000copy
④安全:
失去了转移蛋白基因mob(mobilization)。
不能通过接合转移。
(2)pUC18/19(P43):
拷贝数2000-3000/cell;装有多克隆位点(MCS);正选择颜色标记lacZ’;用于基因克隆和测序。
a.元件来源:
①复制起点:
pBR322的ori
②Ampr基因:
pBR322的Ampr基因,但其上失去了克隆位点。
③lacZ的启动子:
大肠杆菌
④lacZ’基因:
大肠杆菌lacZ的α-肽链序列,是LacZ的氨基端片断。
b.正选择标记lacZ’的显色原理:
β-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
①α-肽(lacZ’):
β-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断(11-41氨基酸)。
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.;
②受体菌lacZ突变(lacZ∆M15)
受体菌基因组的β-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失(缺失α肽),不能形成4聚体的活性酶,不能分解Xgal
③载体lacZ’与α互补
pUC质粒载体上的lacZ’编码α肽与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”,使它能形成4聚体。
又能分解Xgal。
产生蓝色物质。
④α互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区,本身虽不干扰LacZ’的合成,但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。
不能互补。
c.IPTG的诱导作用
IPTG是乳糖的类似物。
能诱导lac操纵子的启动转录,使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。
从而互补。
d.pUC系列载体的优点
①更小的分子量
②选择方便:
Xgal显色、抗菌素双重直接选择。
③克隆便利:
具有多克隆位点(MCS)
④测序方便
(3)pGEM-3Z
由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。
可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录
pGEM-3Z的特点:
①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶,在试管里就可以转录mRNA
②外源基因正接反接都可以转录。
③MCS与pUC18的完全一样。
(5)噬菌体或病毒DNA(P52-56)
①噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体,因为:
a.高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞;b.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
(6)单链噬菌体载体
①M13的生活周期
M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA,+DNA合成-DNA,形成RFdsDNA,-DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白,组装成新的噬菌体M13,挤出寄主细胞。
②M13载体的构建
a.克隆区域的选定
i.基因间隔区(intergenicregion,IG区)
M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。
ii.酶切位点
IG区内只有一个BsuI切点。
b.加入酶切位点
i.在IG区内加入单一内切酶位点
(7)黏粒质粒(P71-76):
组成包括质粒复制起点(ColE1)、抗性标记(ampr)、cos位点
(8)噬菌粒(phagemidorphasmid)
噬菌粒载体的特点
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体
a.能像M13-DNA那样体外包装,并高效转染受体细胞;b.能像质粒那样在受体细胞中自主复制;c.装载量比常规的M13mp系列要大很多(10kb);d.通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA;e.重组操作简便,筛选容易
(9)人工染色体
酵母人工染色体载体(YAC)
细菌人工染色体载体(BAC)
(10)表达载体构建的原则
1阅读框与外源基因高效表达
2启动子与外源基因高效表达
3转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达
4有效地翻译起始与外源基因高效表达
5终止密码选择与外源基因高效表达
6外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
第四章核酸操作的基本技术
1核酸提取基本原理
(1)碱抽提法提取质粒DNA原理
闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离,复性快;染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质—SDS复合物结合在一起,在离心的时候沉淀下去。
(2)所用的试剂作用
①溶菌酶
能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键。
在碱性条件(pH>8)下有活性。
②葡萄糖
增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械力(震荡)的作用而降解。
③EDTA
Mg2+、Ca2+的螯合剂,可抑制DNA酶的活性,防止DNA被酶降解。
④NaOH-SDS
NaOH:
强碱,提供pH>12的碱性条件,使DNA双链变性。
SDS:
溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白,并结合成“蛋白—SDS”复合物,使蛋白质变性沉淀。
⑤NaAc-HAc缓冲液
冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。
用来中和NaOH变性液,使DNA复性。
高浓度的NaAc有利于变性的大分子沉淀。
⑥乙醇
用于沉淀DNA。
DNA分子以水合状态“溶于”水里,乙醇能夺去DNA分子的水环境。
⑦RNaseA
降解RNA渣滓。
以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
⑧TE缓冲液
DNA保存液。
由Tris-HCl和EDTA配制。
Tris-HCl不含金属离子(不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业),有利于以后操作;EDTA抑制DNA酶,防止DNA被酶降解。
(3)碱抽提法提取质粒DNA的步骤
第一步:
溶菌
使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。
SolutionI的配制:
50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA,4-5mg/ml溶菌酶,RNaseA
第二步:
破膜,蛋白质和DNA变性
溶液II破坏细胞膜,蛋白质和DNA变性。
SolutionII的配制:
0.2NNaOH,1.0%SDS
第三步:
中和
溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。
SolutionIII的配制:
3M醋酸钠(用冰醋酸调pH至4.8)
第四步:
离心除去沉淀
上清液中含有闭合质粒DNA。
第五步:
纯化DNA
上清液过柱或酚-氯仿抽提。
第六步:
沉淀DNA
0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。
2基因组或其他DNA的提取
3DNA的定量和纯度测定
4核酸的保存
(1)DNA的保存
最好是溶于TE中,短时间保存可放于4℃冷藏室。
—70℃下DNA能保存5年以上,一般的长期保存只需放于—2
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