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高效液相色谱资料
高效液相色谱资料
色谱法的分离原理:
溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationaryphase)发生作
用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,
从而先后从固定相中流出。
HPLC有以下特点:
高压——压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。
高速——HPLC流速一般为0.1~10.0ml/min,制备型可达100ml/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng,荧光检测器可达0.1pg,同时消耗样品少。
基本参数:
色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elutionprofile)。
基线(baseline)——经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。
不对称色谱峰有两种:
前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。
前者少见。
拖尾因子(tailingfactor,T)——T=,用以衡量色谱峰的对称性。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。
峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peakheight,h)——峰的最高点至峰底的距离。
峰宽(peakwidth,W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
半峰宽(peakwidthathalf-height,Wh/2)——峰高一半处的峰宽。
标准偏差(standarddeviation,σ)——正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。
峰面积(peakarea,A)——峰与峰底所包围的面积。
2.定性参数(保留值)
死时间(deadtime,t0)——不保留组分的保留时间。
即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。
死体积(deadvolume,V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
保留时间(retentiontime,tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积(retentionvolume,VR)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。
又称洗脱体积。
VR=F×tR
调整保留时间(adjustedretentiontime,t'R)——扣除死时间后的保留时间。
也称折合保留时间(reducedretentiontime)。
在实验条件(温度、固定相等)一定时,t'R只决定于组分的性质,因此,t'R(或tR)可用于定性。
t'R=tR-t0
调整保留体积(adjustedretentionvolume,V'R)——扣除死体积后的保留体积。
V'R=VR-V0或V'R=F×t'R
3.柱效参数
理论塔板数(theoreticalplatenumber,N)——用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。
它把色谱柱看作分馏塔,把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程,即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。
塔板理论的基本假设为:
1)色谱柱内存在许多塔板,组分在塔板间隔(即塔板高度)内完全服从分配定律,并很快达到分配平衡。
2)样品加在第0号塔板上,样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。
3)流动相在色谱柱内间歇式流动,每次进入一个塔板体积。
4)在所有塔板上分配系数相等,与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符,如色谱过程是一个动态过程,很难达到分配平衡;组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。
但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程,成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置,能够评价色谱柱柱效。
4.相平衡参数
分配系数(distributioncoefficient,K)——在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。
。
容量因子(capacityfactor,k)——化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的量之比。
5.分离参数
分离度(resolution,R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。
应用领域:
适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物;生物活性物质和多种天然产物;合成的和天然的高分子化合物等。
环境,农业,石油,化工,材料,食品,生物,医药等。
液相的分类:
可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性、容易购买等特征:
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC))和亲和色谱法。
按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法
1.液固色谱法 使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。
适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。
常用于分离同分异构体。
2.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。
分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。
由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用。
现在多采用的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。
反相色谱法 一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。
为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。
但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8),太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落。
有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法
反相色谱法
固定相极性
高~中
中~低
流动相极性
低~中
中~高
组分洗脱次序
极性小先洗出
极性大先洗出
从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线(如氨基键合固定相)。
3.离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架,在表面末端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)。
被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。
被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子强度影响。
pH值可改变化合物的解离程度,进而影响其与固定相的作用。
流动相的盐浓度大,则离子强度高,不利于样品的解离,导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.离子对色谱法 又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支。
它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分离效果改善。
主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。
另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10mmol/L的离子对试剂,在一定的pH值范围内进行分离。
被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5.排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的溶剂。
小分子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长;大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。
它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。
常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。
其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。
目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司(原HP公司)、岛津公司、瓦里安等,国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂、上海伍丰等
泵的作用:
将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。
分类:
柱塞往复泵
注射泵
隔膜泵
装置要求:
①流量稳定;
②流量范围宽;
③输出压力高;
④液缸容积小;
⑤密封性能好,耐腐蚀。
柱塞往复泵:
结构:
单向阀、密封圈、柱塞杆、偏芯轮、缸体。
性能指标:
在1ml/min的流速下,流量设定值误差SS<3%,流量稳定性误差SR<2%。
进样器:
装置要求:
密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小
分类:
隔膜进样
停流进样
阀进样
自动进样
一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见),关键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。
六通进样阀:
色谱柱:
要求是:
柱效高
选择性好
分析速度快
组成:
由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。
色谱柱的维护
1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)
2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围
3.避免流动相组成及极性的剧烈变化
4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存于有机溶剂中
6.压力升高是需要更换预柱的信号
检测器:
作用是连续检测色谱柱流相物质中样品的浓度或量,完成色谱分析中定性、定量分析,并把检测到的组分的量转变为电信号。
要求灵敏度高、噪音低、线性范围宽、重复性好和适用范围广、对样品无破坏性、定性、定量、方便便宜。
常用的检测器:
紫外检测器(UV),光二极管阵列检测器(DAD),荧光检测器(FLD),蒸发光散射检测器(ELSD),示差折光检测器(RID),质谱检测器(MS),电化学检测器(ECD)等。
性能指标:
噪音和漂移,灵敏度(sensitivity),检测限(detectionlimit),线性范围(linearrange)
紫外检测器(UV)和光二极管阵列检测器(DAD):
原理:
通过样品在检测池中吸收紫外-可见光的大小来确定样品含量的。
即:
Lambert-Beer定律,即当一束单色光透过流动池时,若流动相不吸收光,则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比.
A=εCL
ε:
吸光系数
C:
吸光组分的浓度
L:
流动池的光径长度
特点:
1.为选择性检测器,基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收。
2.灵敏度高
3.噪音低
4.线性范围宽
5.如果使用的流动相中含有紫外吸光杂质,则会降低灵敏度,
6.进行梯度脱洗时,会产生漂移。
7.光二极管阵列检测器(DAD)还具有定性的功能,所得图谱为由吸光度(A),波长(λ),时间(t)的三维空间立体图谱。
应用:
物质中含有不饱和键或未共用电子对,能产生能极跃迁,都会有吸收。
荧光检测器(FLD):
原理:
通过某些溶质在受紫外光激发后,能发射可见光(荧光)的性质来进行检测的。
特点:
1.为选择性检测器,只是对产生荧光的物质有吸收;
2.灵敏度比紫外检测器高100倍,特别适用于痕量组分的选择性测定;
3.线性范围较窄,可用于梯度洗脱;
4.不能用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂做流动相;
应用:
某些代谢物、食物、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱、胆碱和甾类化合物等。
蒸发光散射检测器(ELSD):
原理:
当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会产生光散射现象,在一定角度测得的光散射强度取决于烟雾粒子的大小和数量。
且在一定条件下粒子数量不变,光散射强度正比于由溶质浓度决定的粒子的大小。
1.溶剂流2.喷雾器
3.雾化器4.蒸发器
5.光阱6.光源
7.排气口
特点:
1.为通用性检测器,多任何物质都有响应;
2.灵敏度高。
3.对流动相系统温度变化影响不敏感。
4.可进行梯度洗脱,没有基线漂移问题。
5.对所有的组分响应几乎相等,响应值只取决于光束中溶质颗粒的大小与数目,与化学组成关系不大。
应用:
除进行一般检测外,还应用在药物分析、生化物质测定、高分子聚合物分子量测定等,也用于凝胶渗透色谱和超临界流体色谱,细内径柱中。
示差折光检测器(RID):
原理:
任意一束光由一种介质射入另一种介质时,由于两种介质的折射率不同而发生折射现象。
就是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的,溶有样品的流动相和流动相本身之间折射率之差反映了样品在流动相的浓度。
特点:
1.是通用型检测器,对所有的样品都有响应;
2.是中等灵敏度检测器,检测限是10-6g/ml~10-7g/ml;线性范围较窄,小于105;
3.对压力和温度变化很敏感;
4.不可用于梯度洗脱。
分类:
反射式、折射式、干涉式和克里斯琴效应示差折光检测器。
电化学检测器(ECD):
原理:
电化学原理和物质的电化学性质。
分类:
安培、极谱、库仑和电导、电容,其中安培和库仑、电导应用最多。
安培检测器:
应用最广,是在外加电压的作用下,利用待测物质在电极表面上发生氧化还原反应引起电流的变化而进行测定。
安培检测器的特点:
1.灵敏度高,检测限为10-11g~10-13g;
2.选择性高,只对电活性物质有响应,而不受非电活性物质的干扰;
3.线性范围宽,一般是4~5个数量级,有的可达6个数量级;
4.检测池体积小,柱外效应较小,噪声低,响应速度快。
5.流动相必须要有导电性,对流动相的流速、温度、PH值等因素的变化较敏感;
应用:
哺乳动物中枢神经系统代谢物、生化、医学、食品、环境等。
压力异常
操作压力的变化往往是故障的征兆。
从下表中找出所观察到的现象,并在右侧的列表中参考相应的解决方法。
A、没有压力显示,没有流动相流动
原因
解决方法
1、电源问题
1、接通电源,开机
2、保险丝被烧坏
2、更换保险丝
3、控制器设定不正确或设定失败
3、a、采取恰当的设定
b、修理或更换控制器
4、柱塞杆折断
4、更换柱塞杆
5、泵头内有空气
5、溶剂脱气、启动泵抽出空气
6、流动相不足
6、a、补充流动相
b、更换入口滤头
7、单向阀损坏
7、更换单向阀
8、漏液
8、拧紧或更换手紧接头
B、流动相流动正常,但没有压力显示
原因
解决方法
1、仪表损坏
1、更换仪表
2、压力传感器损坏
2、更换压力传感器
C、压力持续偏高
原因
解决方法
1、流速设定过高
1、调整流速设定
2、柱前筛板堵塞
2、a、在允许情况下反冲色谱柱
b、更换筛板
c、更换色谱柱
3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀
3、a、使用恰当的流动相
b、冲洗色谱柱
4、色谱柱选择不当
4、选择恰当的色谱柱
5、进样阀损坏
5、清洗或更换进样阀
6、柱温过低
6、提高温度
7、控制器失常
7、修理或更换控制器
8、保护柱阻塞
8、清洗或更换保护柱
9、在线过滤器阻塞
9、清洗或更换在线过滤器
D、压力持续偏低
原因
解决方法
1、流速设定过低
1、调整流速
2、系统漏液
2、确定漏液位置并维修
3、色谱柱选择不当
3、选择恰当的色谱柱
4、柱温过高
4、降低温度
5、控制器失常
5、维修或更换控制器
E、压力不断上升
原因
解决方法
1、见列表C
1、见列表C
F、压力降为零
原因
解决方法
1、见列表A、B
1、见列表A、B
G、压力不断下降,但不回零
原因
解决方法
1、见列表D
1、见列表D
H、压力波动
原因
解决方法
1、泵中有气体
1、a、溶剂脱气
b、从泵中除去气体
2、单向阀损坏
2、更换单向阀
3、泵密封损坏
3、更换泵密封
4、脱气不充分
4、a、溶剂脱气
b、改变
5、系统漏液
5、确定漏液位置并维修
6、使用梯度洗脱
6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动
漏液
通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。
但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。
如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题,就必须将接头取下,检查是否损坏(例如,卡套损坏、密封表面有杂质);损坏的接头应该更换掉。
A、接头处漏液
原因
解决方法
1、接头松动
1、拧紧
2、接头磨损
2、更换
3、接头过紧
3、a、拧松,再重新拧紧
b、更换
4、接头被污染
4、a、拆下清洗
b、更换
5、部件不匹配
5、使用同一品牌的配件
B、泵漏液
原因
解决方法
1、单向阀松动
1、a、拧紧单向阀(不必拧的过紧)
b、更换单向阀
2、接头松动
2、拧紧接头(不必拧的过紧)
3、混合器密封损坏
3、a、更换混合器密封
b、更换混合器
4、泵密封损坏
4、维修或更换泵密封件
5、压力传感器损坏
5、维修或更换压力传感器
6、脉冲阻尼器损坏
6、更换脉冲阻尼器
7、比例阀损坏
7、a、检查隔膜,如果漏液立即更换
b、检查手紧接头,损坏的立即更换
8、放空阀的损坏
8、a、拧紧放空阀
b、更换放空阀
C、进样阀漏液
原因
解决方法
1、转子密封损坏
1、重新安装或更换进样阀
2、定量环阻塞
2、更换定量环
3、进样口密封松动
3、调整
4、进样针头尺寸不合适
4、使用恰当的进样针
5、废液管中产生虹吸
5、保持废液管高于废液液面
6、废液管阻塞
6、更换或疏通废液管
D、色谱柱漏液
原因
解决方法
1、尾端接头松动
1、拧紧接头
2、卡套内有填料
2、拆下、清洗卡套、重新安装
3、筛板厚度不合适
3、使用合适的筛板(参考下表)
筛板选择指导
物质粒径
筛板孔径
3-4u
0.5u
5-20u
2u
E、检测器漏液
原因
解决方法
1、流通池垫片损坏
1、a、避免过大的背景压力(压力降)
b、更换垫片
2、流通池窗破碎
2、更换窗口
3、手紧接头漏液
3、拧紧或更换
4、废液管阻塞
4、更换废液管
5、流通池阻塞
5、重新安装或更换
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。
其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。
对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、峰拖尾
原因
解决方法
1、筛板阻塞
1、a、反冲色谱柱
b、更换进口筛板
c、更换色谱柱
2、色谱柱塌陷
2、填充色谱柱
3、干扰峰
3、a、使用更长的色谱柱
b、改变流动相或更换色谱柱
4、流动相PH选择错误
4、调整PH值。
对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰
5、样品与填料表面的溶化点发生反应图
5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂
b、更改色谱柱
B、峰前延
原因
解决方法
1、柱温低
1、升高柱温
2、样品溶剂选择不恰当
2、使用流动相作为样品溶剂
3、样品过载
3、降低样品浓度
4、色谱柱损坏
4、见A1、A2
C、峰分叉
原因
解决方法
1、 保护柱或分析柱污染
图
1、取下保护柱再进行分析。
如果必要更换保护柱。
如果分析柱阻塞,拆下来清洗。
如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相
2、改变样品溶剂。
如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、峰变形
原因
解决方法
1、样品过载
1、减少样品载量
E、早出的峰变形
原因
解决方法
1、样品溶剂选择不恰当
1、a、减少进样体积
b、运用低极性样品溶剂
F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原因
解决方法
1、柱外效应
1、a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)
b、使用小体积的流通池
G、K’增加时,脱尾更严重
原因
解决方法
1、二级保留效应,反相模式
1、a、加入三乙胺(或碱性样品)
b、加入乙酸(或酸性样品)
c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品)
d、更换一支柱子
2、二级保留效应,正相模式
2、a、加入三乙胺(或碱性样品)
b、加入乙酸(或酸性样品)
c、加入水(或多官能团化合物)
d、试用另一种方法
3、二级保留效应,离子对
3、加入三乙胺(或碱性样品)
H、酸性或碱性化合物的峰拖尾
原因
解决方法
1、缓冲不合适
1、a、
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