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溶菌酶实验实验报告第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定
实验报告
学院:
生物科学与工程学院
班级:
姓名:
学号:
组别:
第七组
组员:
一、实验内容:
溶菌酶的提取和系列性质测定
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用,才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活,为能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等,这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104,是一种强碱性蛋白质,等电点在10.0以上,并对温度和酸不敏感。
在自然界中,普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中,植物卷心菜、萝卜、木瓜等,以蛋清含量最丰富,约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理,通过阳离子交换层析,硫酸铵沉淀,分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理:
1蛋白质提取分离技术
以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为
具体实验内容
一、实验目的
1、提取鸡蛋清中的溶菌酶
2、测定蛋白质浓度
3、测定溶菌酶的酶活力
二、实验仪器及材料
1、仪器:
柱层析系统(层析柱,恒流泵,紫外监测仪,部分收集器),Sigma高速冷冻离心机,722s分光光度计,透析袋,水浴锅,电泳仪,电泳槽,紫外凝胶成像系统,移液枪(1000ml,200ml,100ml),烧杯,玻璃棒,容量瓶,移液管,洗耳球,
2、材料:
新鲜鸡蛋。
3、试剂:
(1)弱酸性阳离子交换树脂;
(2)磷酸氢二钠;(3)磷酸二氢钠;(4)氯化钠;(5)硫酸铵;(6)氢氧化钠;(7)甘油;(8)盐酸;(9)葡聚糖凝胶G-50;(10)溶壁微球菌干粉;(11)考马斯亮蓝G-250;(12)95%乙醇;(13)85%磷酸;(14)牛血清清蛋白(BSA);(15)脲;(16)丙烯酰胺(Acr);(17)甲叉双丙烯酰胺(Bis);(18)四甲基乙二胺(TEMED);(19)甘氨酸(Gly);(20)过硫酸铵(AP);(21)考马斯亮蓝R-250;(22)三羟甲基氨基甲烷(Tris);(23)2-β-巯基乙醇;(24)十二烷基磺酸钠(SDS);(25)溴酚蓝;(26)冰醋酸;(27)标准蛋白:
SDS-低相对分子质量标准蛋白.
4、试剂配制
(1)0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0;
(2)0.5mol/LNaOH;200ml
(3)0.5mol/LHCl;200ml
(4)含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0;200ml,现配。
(5)含0.05mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0;现配。
(6)含0.5mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0;现配。
(7)含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0;现配。
(8)测活缓冲液:
含30mmol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0;现配。
(9)底物溶液Ⅰ:
40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中;现配,公用。
(10)考马斯亮蓝G-250试剂:
考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤;公用。
(11)标准蛋白质溶液:
用0.1mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液;公用。
(12)底物溶液Ⅱ:
300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中;(生物技术班不用配制)。
(13)10mol/L脲,测活缓冲液配制;(生物技术班不用配制)。
(14)30%胶贮液:
每100mL中含丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g;
(15)1.5mol/LTris-HClpH8.8;购买,不用配。
(16)0.5mol/LTris-HClpH6.8;购买,不用配。
(17)10%(W/V)过硫酸铵;现配。
(18)SDS电泳缓冲液:
25mmol/LTris,0.192mol/LGly,0.1%(W/V)SDS;
(19)10%(W/V)SDS;公用。
(20)染色液:
0.2g考马斯亮蓝R-250,42mL工业酒精,10mL冰醋酸,加蒸馏水至50mL;
(21)脱色液:
5mL冰醋酸,45mL工业酒精,50mL蒸馏水;100ml
(22)保存液:
7%冰醋酸;现配。
(23)2×上样缓冲液:
购买,不用配。
0.5mol/LTris-HClpH6.82mL
甘油2mL
20%SDS2mL
0.1%溴酚蓝0.5mL
2-β-巯基乙醇0.5mL
蒸馏水2.5mL
三:
实验步骤
1酶的提取
(一)样品的制备:
新鲜鸡蛋四个,破蛋壳取出蛋清,加入蛋清体积1.5倍的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0),搅拌均匀,并调pH7.0(NaOH调pH),然后用八层纱布过滤,留取上清液,量取体积并记录,留0.4mL上清液(定为Ⅰ步骤样品)并加入0.4mL甘油-20℃冻存备用。
(二)阳离子交换层析
1.阳离子交换柱的再生:
20g阳离子交换树脂用0.5mol/LNaOH浸泡30min,水洗至中性,再用0.5mol/L盐酸浸泡30min,水洗至中性。
2.平衡:
在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0平衡。
3.吸附:
在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品,搅拌吸附1h(玻璃棒搅拌)。
4.洗涤:
倒去其余上清液,树脂用100mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0洗涤3遍。
5.装柱:
将树脂搅拌均匀装入离子交换柱,再用300mL含0.05mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0洗涤杂蛋白。
(装柱前,先检查层析柱是否干净,保证所有接头密闭、管道通畅;装柱时,流速不超过3mL/min,全过程绝对不能出现流干现象)。
6.洗脱:
用300mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0以3mL/min的流速进行洗脱,合并光吸收高峰管,量取体积并记录,留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油,-20℃冻存备用(定为Ⅱ步骤样品)。
(三)硫酸铵沉淀
每100mL上清液中缓慢加入35g硫酸铵固体,溶解后静置30min,10000rpm离心10min,沉淀用0.5mL左右含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0溶解,留0.05mL上清液并加入0.05mL甘油,-20℃冻存备用(定为Ⅲ步骤样品)。
四注意事项
1.上样前,层析柱要达到平衡。
2.上样后要控制流速。
(四)实验数据
图1酶提取仪器稳定图
图2酶提取平衡图
图三酶提取洗脱图
2酶的纯化
2.1分子筛层析
(1)溶胀:
取葡聚糖凝胶G-503g,加60mL蒸馏水沸水浴中煮沸2h,充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒,如此反复洗涤2~3次,最后加入等体积含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液备用。
(2)装柱:
将凝胶悬浮液搅拌均匀后一次连续性倾入柱中,控制流速≦15mL/h,自然沉降(注意:
绝对不能出现“流干”现象,不能有气泡和分层,胶面一定要平整)。
(3)平衡:
用含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液平衡两个柱体积,控制流速≦15mL/h。
(4)上样:
将溶解后的硫酸铵沉淀样品10000rpm离心3min后上样,当样品进入胶面后,再用平衡缓冲液约0.5mL洗管壁和胶面3次(注意:
绝对不能出现“流干”现象和破坏胶面的平整性)。
(5).洗脱:
用含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液洗脱,控制流速≦15mL/h,自动部分收集器收集,2mL/管,紫外监测仪检测洗脱峰或比色法测定洗脱峰。
合并光吸收及酶活高峰管。
2.2透析浓缩
用含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH4.0透析浓缩4h,-20℃分装保存备用(定为Ⅳ步骤样品)。
2.3实验图谱
图4酶纯化稳定图
图5酶纯化峰值图
2.4注意事项
1).层析柱上方要留有少量液体,避免使凝胶暴露于空气中。
2).凝胶过滤上样时,使样品沿管壁缓缓流下,勿冲破胶面
3酶活力、蛋白浓度测定
3.1蛋白浓度的测定
(1)标准曲线的制定
取14支试管,按下表分两组进行平行操作。
管号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质溶液/ml
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
缓冲液
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝G-250
5ml
摇匀,1h内以0号试管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
0
0.051
0.089
0.119
0.169
0.205
0.235
绘制标准曲线:
以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
图6蛋白质测定标准曲线图
(2)测定未知样品蛋白质浓度
管号
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
吸光度
0.118
0.056
0.073
0.610
稀释倍数
10
10
100
10
蛋白浓度
0.2846
0.1258
1.6933
0.01546
2.酶活力测定
管号
1
2
测活缓冲液/ml
2.5
3.0
底物溶液/ml
2.5
2.5
酶液/ml
0.5
0
在室温,以1号管为对照,每隔30s测定2号595nm处的光吸收值
时间
样品号
0s
30s
60s
90s
120s
150s
180s
A595nm
Ⅰ
0.017
0.107
0.135
0.170
0.187
0.210
0.224
Ⅱ
0.124
0.142
0.167
0.195
0.213
0.235
0.254
Ⅲ
0.131
0.156
0.181
0.207
0.226
0.238
0.253
Ⅳ
0.257
0.328
0.348
0.350
0.357
0.366
0.370
四、注意事项
酶活测定和蛋白定量实验中所用试管、刻度吸管要干燥,量取试剂要准确。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对
分子量及纯度鉴定
1.配制15%的分离胶
(1)用胶框封好玻璃板后架好胶板。
(2)按如下比例配好分离胶,混合后立即加入到电泳槽两玻璃板之间到上口约2cm止,再加约1ml蒸馏水水封,聚合后将水吸干。
蒸馏水
1.5mol/LTris-HClpH8.8
胶贮液
10%SDS
TEMED
10%AP
4.7mL
5mL
10mL
200uL
10uL
100uL
2.配制4%的浓缩胶
蒸馏水
0.5mol/LTris-HClpH6.8
胶贮液
10%
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- 溶菌酶 实验 报告 第七
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