猪瘟防治技术规范.docx

猪瘟防治技术规范.docx

《猪瘟防治技术规范.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪瘟防治技术规范.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

猪瘟防治技术规范

猪瘟防治技术规范

猪瘟（Classicalswinefever,CSF）是由黄病毒科瘟病毒属猪

瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。

世界动物卫

生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物

疫病。

为及时、有效地预防、控制和扑灭猪瘟，依据《中华人民共和国

动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情

应急预案》及有关法律法规，制定本规范。

本规范规定了猪瘟的诊断、疫情报告、疫情处臵、疫情监测、预

防措施、控制和消灭标准等。

本规范适用于中华人民共和国境内一切从事猪（含驯养的野猪）

的饲养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和

个人。

依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，

确诊需做病原分离与鉴定。

猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不

同年龄、性别、品种的猪均易感。

一年四季均可发生。

感染猪在发病

前即能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。

与感染猪直接接

触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等

传播，人、其它动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。

185

感染和带毒母猪在怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔

猪发病或产生免疫耐受。

2.2.1本规范规定本病潜伏期为3-10天，隐性感染可长期带毒。

根据临床症状可将本病分为急性、亚急性、慢性和隐性感染四种

类型。

2.2.2典型症状

2.2.2.1发病急、死亡率高；

2.2.2.2体温通常升至41?

以上、厌食、畏寒；

2.2.2.3先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；

2.2.2.4腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑

点，指压不褪色，眼结膜和口腔黏膜可见出血点。

2.3.1淋巴结水肿、出血，呈现大理石样变；

2.3.2肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点；

2.3.3全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血

点和出血斑，脾脏边缘出现梗死灶；

2.3.4脾不肿大，边缘有暗紫色突出表面的出血性梗死；

2.3.5慢性猪瘟在回肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状”溃疡。

实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。

2.4.1病原分离与鉴定

2.4.1.1病原分离、鉴定可用细胞培养法（见附件1）；

2.4.1.2病原鉴定也可采用猪瘟荧光抗体染色法，细胞浆出现特

异性的荧光（见附件2）；

186

2.4.1.3兔体交互免疫试验（附件3）；

2.4.1.4猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：

主要用于临床诊断与病原监测（见附件4）。

2.4.1.5猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测法：

主要用于临床诊断

与病原监测（见附件5）。

2.4.2血清学检测

2.4.2.1猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测法（见附件6）；

2.4.2.2猪瘟荧光抗体病毒中和试验（见附件7）：

2.4.2.3猪瘟中和试验方法（见附件8）。

2.5.1疑似猪瘟

符合猪瘟流行病学特点、临床症状和病理变化。

2.5.2确诊

非免疫猪符合结果判定2.5.1，且符合血清学诊断2.4.2.1、2.4.2.2、2.4.2.3之一，或符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、2.4.1.3、2.4.1.4、2.4.1.5之一的；

免疫猪符合结果2.5.1，且符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、2.4.1.3、2.4.1.4、2.4.1.5之一的。

3.1任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的猪，都应当立即

向当地动物防疫监督机构报告。

3.2当地动物防疫监督机构接到报告后，按国家动物疫情报告管

理的有关规定执行。

根据流行病学、临床症状、剖检病变，结合血清学检测做出的临

187

床诊断结果可作为疫情处理的依据。

4.1当地县级以上动物防疫监督机构接到可疑猪瘟疫情报告后，

应及时派员到现场诊断，根据流行病学调查、临床症状和病理变化等

初步诊断为疑似猪瘟时，应立即对病猪及同群猪采取隔离、消毒、限

制移动等临时性措施。

同时采集病料送省级动物防疫监督机构实验室

确诊，必要时将样品送国家猪瘟参考实验室确诊。

4.2确诊为猪瘟后，当地县级以上人民政府兽医主管部门应当立

即划定疫点、疫区、受威胁区，并采取相应措施；同时，及时报请同

级人民政府对疫区实行封锁，逐级上报至国务院兽医主管部门，并通

报毗邻地区。

国务院兽医行政管理部门根据确诊结果，确认猪瘟疫情。

4.2.1划定疫点、疫区和受威胁区

为病猪和带毒猪所在的地点。

一般指病猪或带毒猪所在的

猪场、屠宰厂或经营单位，如为农村散养，应将自然村划为疫点。

是指疫点边缘外延3公里范围内区域。

疫区划分时，应注

意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）等因素。

：

是指疫区外延5公里范围内的区域。

4.2.2封锁

由县级以上兽医行政管理部门向本级人民政府提出启动重大动物

疫情应急指挥系统、应急预案和对疫区实行封锁的建议，有关人民政

府应当立即做出决定。

4.2.3对疫点、疫区、受威胁区采取的措施

扑杀所有的病猪和带毒猪，并对所有病死猪、被扑杀猪及

其产品按照GB16548规定进行无害化处理；对排泄物、被污染或可能

污染饲料和垫料、污水等均需进行无害化处理；对被污染的物品、交

通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒（见附件9）；限制人员

188

出入，严禁车辆进出，严禁猪只及其产品及可能污染的物品运出。

：

对疫区进行封锁，在疫区周围设臵警示标志，在出入疫区

的交通路口设臵动物检疫消毒站（临时动物防疫监督检查站），对出入的人员和车辆进行消毒；对易感猪只实施紧急强制免疫，确保达到免

疫保护水平；停止疫区内猪及其产品的交易活动，禁止易感猪只及其

产品运出；对猪只排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标

准进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地

进行严格彻底消毒。

对易感猪只（未免或免疫未达到免疫保护水平）实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；对猪只实行疫情监测和免疫效

果监测。

4.2.4紧急监测

对疫区、受威胁区内的猪群必须进行临床检查和病原学监测。

4.2.5疫源分析与追踪调查

根据流行病学调查结果，分析疫源及其可能扩散、流行的情况。

对可能存在的传染源，以及在疫情潜伏期和发病期间售（／运）出的猪只及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应当立即开

展追踪调查，一经查明立即按照GB16548规定进行无害化处理。

4.2.6封锁令的解除

疫点内所有病死猪、被扑杀的猪按规定进行处理，疫区内没有新

的病例发生，彻底消毒10天后，经当地动物防疫监督机构审验合格，

当地兽医主管部门提出申请，由原封锁令发布机关解除封锁。

4.2.7疫情处理记录

对处理疫情的全过程必须做好详细的记录（包括文字、图片和影

像等），并归档。

189

以免疫为主，采取“扑杀和免疫相结合”的综合性防治措施。

5.1饲养管理与环境控制

饲养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理办法》

（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，并加强种猪调运检疫

管理。

5.2消毒

各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫

生（消毒）管理制度，做好杀虫、灭鼠工作（见附件9）。

5.3免疫和净化

5.3.1免疫

国家对猪瘟实行全面免疫政策。

预防免疫按农业部制定的免疫方案规定的免疫程序进行。

所用疫苗必须是经国务院兽医主管部门批准使用的猪瘟疫苗。

5.3.2净化

对种猪场和规模养殖场的种猪定期采样进行病原学检测，对检测

阳性猪及时进行扑杀和无害化处理，以逐步净化猪瘟。

5.4监测和预警

5.4.1监测方法

：

以流行病学调查、血清学监测为主，结合病原鉴定。

：

以病原监测为主，结合流行病学调查、血清学监测。

5.4.2监测范围、数量和时间

对于各类种猪场每年要逐头监测两次；商品猪场每年监测两次，

抽查比例不低于0.1%，最低不少于20头；散养猪不定期抽查。

或按

照农业部年度监测计划执行。

190

5.4.3监测报告

监测结果要及时汇总，由省级动物防疫监督机构定期上报中国动

物疫病预防控制中心。

5.4.4预警

各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做

好预警预报。

5.5消毒

饲养场、屠宰厂（场）、交易市场、运输工具等要建立并实施严格

的消毒制度。

5.6检疫

5.6.1产地检疫

生猪在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检。

动物防疫监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实施检疫。

检疫合格后，出具合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，

对检疫不合格的按照有关规定处理。

5.6.2屠宰检疫

动物防疫监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可

入厂/场屠宰。

检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合

格的按有关规定处理。

5.6.3种猪异地调运检疫

跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫

审批手续，调出地进行检疫，检疫合格方可调运。

到达后须隔离饲养

10天以上，由当地动物防疫监督机构检疫合格后方可投入使用。

191

6.1免疫无猪瘟区

6.1.1该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。

6.1.2有定期、快速的动物疫情报告记录。

6.1.3该区域在过去3年内未发生过猪瘟。

6.1.4该区域和缓冲带实施强制免疫，免疫密度100%，所用疫苗必须符合国家兽医主管部门规定。

6.1.5该区域和缓冲带须具有运行有效的监测体系，过去2年内实施疫病和免疫效果监测，未检出病原，免疫效果确实。

6.1.6所有的报告，免疫、监测记录等有关材料详实、准确、齐

全。

若免疫无猪瘟区内发生猪瘟时，最后一例病猪扑杀后12个月，经实施有效的疫情监测，确认后方可重新申请免疫无猪瘟区。

6.2非免疫无猪瘟区

6.2.1该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。

6.2.2有定期、快速的动物疫情报告记录。

6.2.3在过去2年内没有发生过猪瘟，并且在过去12个月内，没有进行过免疫接种；另外，该地区在停止免疫接种后，没有引进免

疫接种过的猪。

6.2.4在该区具有有效的监测体系和监测区，过去2年内实施疫病监测，未检出病原。

6.2.5所有的报告、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。

若非免疫无猪瘟区发生猪瘟后，在采取扑杀措施及血清学监测的

情况下，最后一例病猪扑杀后6个月；或在采取扑杀措施、血清学监

测及紧急免疫的情况下，最后一例免疫猪被屠宰后6个月，经实施有

192

效的疫情监测和血清学检测确认后，方可重新申请非免疫无猪瘟区。

193

附件1

采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。

通常使用

对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等，加入2%扁桃体、肾脏、脾

脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。

37?

培养48～72小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。

步骤如下：

1.制备抗生素浓缩液（青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL），小瓶分装，-20?

保存。

用时融化。

2.取1～2g待检病料组织放入灭菌研钵中，剪刀剪碎，加入少量

无菌生理盐水，将其研磨匀浆；再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养

液，制成20%（w/v）组织悬液；最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液，

混匀后室温作用1小时；以1000g离心15分钟，取上清液备用。

3.用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层，将所得细胞悬

液以1000g离心10分钟，再用一定量EMEM生长液[含5%胎牛血清（无BVDV抗体），56?

灭活30分钟]、0.3％谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、

6链霉素100IU/mL）悬浮，使细胞浓度为2×10/mL。

4.9份细胞悬液与1份上清液混合，接种6～8支含细胞玻片的莱顿氏管（leighton’s）（或其它适宜的细胞培养瓶）,每管0.2mL；同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照；另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。

5.经培养24、48、72小时，分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物，取出细胞玻片，以磷酸缓冲

盐水（PBS液，pH7.2，0.01M）或生理盐水洗涤2次，每次5分钟，

194

用冷丙酮（分析纯）固定10分钟，晾干，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法

进行检测（见附件2）。

6.根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度，判定病毒在细胞中的增

殖情况，若荧光较弱或为阴性，应按步骤4将组织上清细胞培养物进

行病毒盲传。

临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。

接种细胞

时操作程序如下：

取-20?

冻存全血样品臵37?

水浴融化；向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞；37?

吸附2小时。

弃去接种液，用细胞培养液洗涤细胞二次，然后加入EMEM维持液，37?

培养24至48小时后，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法检测

（见附件2）。

195

附件2

荧光抗体染色法快速、特异，可用于检测扁桃体等组织样品以及

细胞培养中的病毒抗原。

操作程序如下：

1样品的采集和选择

1.1活体采样：

利用扁桃体采样器（鼻捻子、开口器和采样枪）。

采样器使用前均须用3%氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。

首先固定活

猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙

签挑至灭菌离心管并作标记。

1.2其它样品：

剖检时采取的病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾

脏、淋巴结、肝脏和肺等，或病毒分离时待检的细胞玻片。

1.3样品采集、包装与运输按农业部相关要求执行。

2检测方法与判定

2.1方法：

将上述组织制成冰冻切片，或待检的细胞培养片（见

附件1），将液体吸干后经冷丙酮固定5～10分钟，晾干。

滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，臵湿盒中37?

作用30分钟。

然后用PBS液洗涤，自然干燥。

用碳酸缓冲甘油（pH9.0～9.5，0.5M）封

片，臵荧光显微镜下观察。

必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光

的特异性。

2.2判定：

在荧光显微镜下，见切片或细胞培养物（细胞盖片）

中有胞浆荧光，并由抑制试验证明为特异的荧光，判猪瘟阳性；无荧

光判为阴性。

2.3荧光抑制试验：

将两组猪瘟病毒感染猪的扁桃体冰冻切片，

分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清（猪瘟中和抗体阴性），在湿盒中

196

37?

作用30分钟，用生理盐水或PBS（pH7.2）漂洗2次，然后进行荧

光抗体染色。

经用猪瘟高免血清处理的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不

应出现荧光，或荧光显著减弱；而用阴性血清处理的切片，隐窝上皮

细胞仍出现明亮的黄绿色荧光。

197

附件3

本方法用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒。

1试验动物

家兔1.5～2kg、体温波动不大的大耳白兔，并在试验前1天测基础体温。

2试验操作方法

将病猪的淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水作1：

10稀释，对3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另设3只不注射病料的对照兔，间

隔5天对所有家兔静脉注射1:

20的猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒），1mL/只，24h后，每隔6小时测体温一次，连续测96小时，对照组2/3出现定型热或轻型热，试验成立。

3兔体交互免疫试验结果判定

接种病料后体温反接种猪瘟兔化弱毒后体温结果判定

应反应

--含猪瘟病毒

-+不含猪瘟病毒

+-含猪瘟兔化病毒

++含非猪瘟病毒热原性物

质

注：

“+”表示多于或等于三分之二的动物有反应。

198

附件4

RT-PCR方法通过检测病毒核酸而确定病毒存在，是一种特异、敏

感、快速的方法。

在RT-PCR扩增的特定基因片段的基础上，进行基因

序列测定，将获得的基因信息与我国猪瘟分子流行病学数据库进行比

较分析，可进一步鉴定流行毒株的基因型，从而追踪流行毒株的传播

来源或预测预报新的流行毒株。

1材料与样品准备

1.1材料准备：

本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；

各种离心管和带滤芯吸头需无RNA酶污染；剪刀、镊子和研钵器须经

干烤灭菌。

1.2样品制备：

按1：

5（W/V）比例，取待检组织和PBS液于研钵中充分研磨，4?

，1000g离心15分钟，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次备用；其它样品酌情处理。

制备的样品在2～8?

保存不应超过24小时，长期保存应小分装后臵-70?

以下，避免反复冻融。

2RNA提取

2.1取1.5mL离心管，每管加入800μLRNA提取液（通用Trizol）和被检样品200μL，充分混匀，静臵5分钟。

同时设阳性和阴性对照

管，每份样品换一个吸头。

2.2加入200μL氯仿，充分混匀，静臵5分钟，4?

、12000g离

心15分钟。

2.3取上清约500μL（注意不要吸出中间层）移至新离心管中，

199

加等量异丙醇，颠倒混匀，室温静臵10分钟，4?

、12000g离心10分钟。

2.4小心弃上清，倒臵于吸水纸上，沾干液体；加入1000μL75%乙醇，颠倒洗涤，4?

、12000g离心10分钟。

2.5小心弃上清，倒臵于吸水纸上，沾干液体；4000g离心10分钟，将管壁上残余液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到

有沉淀的一面，每份样品换一个吸头，室温干燥。

2.6加入10μLDEPC水和10URNasin,轻轻混匀，溶解管壁上

的RNA，4000g离心10分钟，尽快进行试验。

长期保存应臵-70?

以下。

3cDNA合成

取200μLPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加

10μLRNA和50pM下游引物P2（5’-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC-3’），按反转录试剂盒说明书进行。

4PCR

4.1取200μLPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管

加上述10μLcDNA和适量水，95?

预变性5分钟。

4.2每管加入10倍稀释缓冲液5μL，上游引物P1（5’-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3’）和下游引物P2各50pM，10mol/LdNTP2μL，Taq酶2.5U，补水至50μL。

4.3臵PCR仪，循环条件为95:

C50sec，58:

C60sec，72:

C35sec，共40个循环，72:

C延伸5分钟。

5结果判定

取RT-PCR产物5μL，于1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含0.5μL/mL溴化乙锭，电泳缓冲液为0.5×TBE，80V30分钟，电泳完后于长

200

波紫外灯下观察拍照。

阳性对照管和样品检测管出现251nt的特异条

带判为阳性；阴性管和样品检测管未出现特异条带判为阴性。

201

附件5

本方法通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心，并采用辣

根过氧化物酶标记物检测，对外周血白细胞、全血、细胞培养物以及

组织样本中的猪瘟病毒抗原进行检测的一种双抗体夹心ELISA方法。

具体如下：

1试剂盒组成

1.1多克隆羊抗血清包被板条8孔×12条（96孔）

1.2CSFV阳性对照，含有防腐剂1.5mL

1.3CSFV阴性对照，含有防腐剂1.5mL

1.4100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100×）

辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含防腐剂200uL

1.510倍浓缩样品稀释液（10×）55mL

1.6底物液，TMB/HO溶液12mL22

1.7终止液，1MHCL（小心，强酸）12mL

1.810倍浓缩洗涤液（10×）125mL

1.9CSFV单克隆抗体，含防腐剂4mL

1.10酶标抗体稀释液15mL

2样品制备

注意：

制备好的样品或组织可以在2～7?

保存7天，或-20?

冷

202

冻保存6个月以上。

但这些样品在应用前应该再次以1500g离心10分钟或10000g离心2～5分钟。

2.1外周血白细胞

2.1.1取10mL肝素或EDTA抗凝血样品，1500g离心15～20分钟。

2.1.2再用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500uL样品稀释液（1×）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放臵1小时，期间不时旋涡混

合。

然后直接进行步骤2.1.6操作。

2.1.3假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细

胞团（包括红细胞）。

将细胞加进10mL的离心管，并加入5mL预冷（2～7?

，下同）的0.17MNHCl。

混匀，静臵10分钟。

4

2.1.4用冷（2～7?

）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠

倒混匀，1500g离心5分钟。

2.1.5弃去上清，向细胞团中加入500uL样品稀释液（1×）,用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放臵1小时。

期间不时旋涡混合。

2.1.61500g离心5分钟,取上清液按操作步骤进行检测。

注意：

处理好的的样品可以在2～7?

保存7天，或-20?

冷冻保存6个月以上。

但这些样品在使用前必须再次离心。

2.2外周血白细胞（简化方法）

2.2.1取0.5～2mL肝素或EDTA抗凝血与等体积冷0.17MNHCl4加入离心管混合。

室温放臵10分钟。

203

2.2.21500g离心10分钟（或10000g离心2－3分钟），弃上清。

2.2.3用冷（2～7?

）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠

倒混匀，1500g离心5分钟。

2.2.4弃去上清，向细胞团加入500ul样本稀释液（1×）。

旋涡振荡充分混匀，室温放臵1小时。

期间不时旋涡混匀。

取75ul按照“操作步骤”进行检测。

2.3全血（肝素或EDTA抗凝）

2.3.1取25uL10倍浓缩样品稀释液（10×）和475uL全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。

2.3.2室温下孵育1小时，期间不时旋涡混合。

此样品可以直接

按照“操作步骤”进行检测。

或：

直接将75uL全血加入酶标板孔中，再加入10uL5倍浓缩样品稀释液（5×）。

晃动酶标板／板条，使样品混合均匀。

再按照“操

作步骤”进行检测。

2.4细胞培养物

2.4.1移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入离心管中。

2.4.22500g离心5分钟，弃上清。

2.4.3向细胞团中加入500uL样品稀释液（1×）。

旋涡振荡充分混匀，室温孵育1小时。

期间不时旋涡混合。

取此样品75uL按照“操作步骤”进行检测。

2.5组织

最好用新鲜的组织。

如果有必要，组织可以在处理前于2～7?

冷

204

藏保存1个月。

每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、

肠系膜淋巴结或肺。

2.5.1取1～2g组织用剪刀剪成小碎块（2～5mm大小）。

2.5.2将组织碎块加入10mL离心管，加入5mL样品稀释液