婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定修改说明精.docx

婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定修改说明精.docx

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婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定修改说明精

GB/T5413.17-1997《婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定》修改说明

方法一

目前测定有两种方法，方法一是微生物法，为等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC）方法，虽然操作步骤繁杂，但测定结果准确度高。

方法二是高压液相色谱法，是经实验确定的一种快速、准确的方法。

《GB5413.17-1997婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定》中，方法一中原国标中对trizma描述不详细。

下面将《GB/T5413.17-1997婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定》修改内容逐一说明。

1、原标准：

3.6菌种:

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）

修改：

3.6菌种:

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014

说明：

用编码更准确明了因为其有唯一性

2、原标准：

4仪器常用实验室仪器及pH计。

修改：

4仪器

常用实验室仪器及分光光度仪，pH计

说明：

原标准无分光光度仪。

浊度法也是AOAC推荐方法，请参考AOACOfficialMethodsAnalysis（1990）15Edition:

4thsupplement（1993）

3、增加3.8Tris缓冲溶液：

将24.2g三羟基氨基甲烷溶于150ml水中，用7.5mol/lNaOH调pH至8.0-8.3，然后定容至200ml，贮存于4℃冰箱中，可保存2周。

说明：

原标准无此项

4、增加3.92%碱性磷酸酶溶液：

称取2g碱性磷酸酶溶于水中，然后定容至100ml。

说明：

原标准无此项

5、增加3.1010%鸽子肝脏提取物溶液：

将所用容器在配此试剂前一天放入4冰箱过夜。

说明：

原标准无此项

6、增加3.10.1称取30g鸽子肝脏丙酮提取物粉末放入冷的研钵中，分2次加入300ml0.2mol/lKHCO3至0℃的冰浴中研磨均匀直至呈悬浊液。

说明：

原标准无此项

7、增加3.10.2将上清液放入500ml预冷的广口烧瓶中，加150g活性Dowexl-X8放在冰浴中振摇5min，将混合液倒入离心管中，3000r/min离心5min。

说明：

原标准无此项

8、增加3.10.3再将上清液放入另一个500ml预冷的广口烧瓶中，冷冻10min。

说明：

原标准无此项

9、增加3.10.4重复3.10.2和3.10.3步骤一次。

然后分装于试管中，冷冻条件下保存，用前化冻。

说明：

原标准无此项

方法二

目前测定产品中泛酸含量的标准是GB/T5413.17-1997《婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定》。

该方法是在1997年制定的，由于受到当时科技条件的限制，方法存在含淀粉样品溶解困难、标样浓度不适宜等问题，同时由于新品种优良色谱柱的出现，流动相条件也有待于调整，先对各修订条款进行说明。

一、修改内容

1.称样量的大小

考虑含淀粉样品称样量过大时，不易被水充分溶解，同时婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸的含量高出检测限很多，故减小称样量，乳粉称样量约5g,含淀粉量较大的样品称样量约为2g。

2.淀粉酶使用量

由于含淀粉样品用水溶解后成浆糊状，粘稠度过高，不好调pH值，而且不易过滤，所以样品中需加入淀粉酶，于45℃恒温培养箱中酶解半小时。

在不影响样品酶解效果的前提下，可适当的减少酶的用量，可以减少酶所带来的干扰物，便于分离。

通常情况下，2g含淀粉样品，应加入0.2g左右的高峰氏淀粉酶。

3.离心与过滤

由于样品处理时液体量大，所以离心分离时，要求离心管的容积也要大。

另外，离心过程中，容易发生离心管破碎的情况，同时离心后，还要洗沉淀残渣，较为繁琐。

故可以省略离心这一步骤，直接过滤后冲洗沉淀残渣和三角瓶，简单安全，易操作。

4.标准工作液浓度的选择

对于标准工作溶液的浓度，应与由样品处理成的待测液的浓度大小一致，以提高测量的准确度。

所以原标准工作溶液的浓度应再稀释十倍。

5.色谱条件的选择

随着色谱柱技术的改进和发展，过去的色谱柱填充剂已经被淘汰或不生产，所以用现在常用色谱柱代替。

色谱柱换了，流动相也要随着相应调整，综合考虑分离效率、保留时间、基线稳定和色谱柱的使用寿命，选用和推荐现在的流动相。

二、修改后各项参数考察

按照修订后的方法，组织多家实验室进行了方法验证，现将方法验证测定结果的重现性限和再现性限计算如下：

三家实验室参加了该方法的验证，参试样品6个：

水平

水平1

水平2

水平3

水平4

水平5

水平6

样品名称

奶粉1

奶粉2

奶粉3

米粉1

米粉2

米粉3

1、标准曲线的绘制

为确保待测液中的泛酸在线性范围内，必须使含量控制在一定范围内：

经测定表明，以泛酸含量为1.00、2.00、4.00、8.00、12.00µg/ml系列浓度与峰高间符合比尔定律，具有线性关系。

通过计算其回归方程为Y=382.32X+179.15；相关系数R=0.9952。

由此证明，该标准系列浓度范围内线性相关性好。

泛酸标准系列浓度及峰高间回归方程与相关系数

泛酸

1.00

2.00

4.00

8.00

12.00

峰高

497

874

1748

3510

4589

回归方程

Y=382.32X+179.15

相关系数ｒ

R=0.9952

泛酸标准曲线

1.1分析结果的计算

高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸含量采用在一定浓度的范围内符合比尔定律的原理，通过绘制标准回归曲线的方式，查出样品待测液中泛酸的浓度，从而计算出样品中的含量。

对于泛酸含量较高的样品，可通过减少称样量或稀释等方法将泛酸的浓度控制在适当的范围，保证测定液中泛酸的浓度在线性范围内。

另外，由于婴幼儿奶粉及米粉产品中，泛酸含量的表述是以泛酸计的，因此结果不必换算成泛酸钙或泛酸钠。

虽然在实验中所称量的标样是泛酸钙，但在计算标样浓度时已经将其转化成泛酸的浓度，因此在最后结果计算公式中，不乘泛酸钙与泛酸的换算系数

1.2线性范围

为了确定本标准适用的线性区间，设计实验测定方法线性范围。

在允许的范围内，泛酸标准系列浓度为“1.00,2.00,4.00,8.000，12.00μg/ml”，经验证符合比尔定律。

标准系列浓度测定结果及线性回归方程及相关系数见上表。

1.3最低检测限

根据GB/T5009.1-2003，中A2.2吸光法和荧光法中的计算方法。

计算检出限：

式中：

b－标准曲线回归方程中的斜率。

s—二次空白值的标准偏差;

K—根据一定置信度确定的系数,按3计算。

结果：

确认样品检出限为157µg/kg。

1.4准确度

为了确定本方法的准确度,根据GB/T5009.1-2003，我们选用不同泛酸含量的6个样品分别按照标准讨论稿的方法进行回收率测定。

其测定结果见表2。

表2婴幼儿粉泛酸回收率测试结果

实验室

水平

本底值（µg）

添加量（µg）

实测值（µg）

回收率（µg）

国家乳制品质量监督检验中心

水平1

187.12

200.00

201.02

100.5

水平2

209.22

200.00

196.45

97.8

水平3

233.86

200.00

198.78

99.8

水平4

28.50

30.00

30.21

100.7

水平5

45.42

45.00

44.62

99.2

水平6

44.57

45.00

44.29

98.4

1.5精密度

由我中心统一制备样品，同时发送到2个参加方法验证的实验室进行精密度测定。

每个样品共测定6次，并计算相对偏差及CV%值。

结果见表3。

1.5.1方法的实验室内精密度

国家乳制品质量监督检验中心实验室内精密度见下表

重复次数

水平1

水平2

水平3

水平4

水平5

水平6

1

3769.7

4140.7

4630.6

1422.1

2351.6

2220.5

2

3753.7

4130.0

4661.5

1410.2

2254.3

2262.8

3

3723.0

4183.0

4609.1

1439.8

2295.1

2201.4

4

3739.1

4201.4

4674.6

1428.2

2314.1

2256.1

5

3741.2

4245.1

4663.4

1432.1

2214.1

2195.0

6

3728.7

4206.1

4824.2

1418.4

2198.2

2235.1

单元平均值

3742.57

4184.38

4677.23

1425.13

2271.23

2228.48

标准偏差

17.0246

43.1634

75.9761

10.4937

59.5832

27.9373

相对标准偏差（CV％）

0.45

1.03

1.62

0.74

2.62

1.25

湖南亚华乳业有限责任公司实验室内精密度见下表

重复次数

水平1

水平2

水平3

水平4

水平5

水平6

1

3726.9

3683.0

4574.8

1439.4

2288.7

2201.1

2

3695.6

3820.3

4369.2

1385.9

2275.5

2253.1

3

3759.5

3672.5

4338.0

1363.9

2263.2

2150.1

4

3705.3

3714.0

4265.8

1342.1

2221.0

2200.9

5

3701.9

3726.6

4322.9

1349.6

2167.3

2138.6

6

3765.9

3690.7

4607.3

1357.9

2152.6

2237.3

7

3700.3

3739.8

4562.7

1389.9

2243.9

2253.8

8

3706.6

3666.9

4603.5

1431.0

2269.1

2006.1

单元平均值

3720.25

3714.22

4455.52

1382.46

2235.16

2180.12

标准偏差

27.8282

50.0974

144.1697

36.4923

50.8921

82.6390

相对标准偏差（CV％）

0.75

1.35

3.24

2.64

2.28

3.79

北京世纪维他生物技术有限公司实验室内精密度见下表

重复次数

水平1

水平2

水平3

水平4

水平5

水平6

1

3600

3948

4422

1237

2029

2079

2

3535

3883

4699

1346

2147

2042

3

3626

4017

4530

1452

2036

1906

4

3470

3962

4360

1348

2220

1838

单元平均值

3557.75

3952.50

4502.75

1345.75

2108.00

1966.25

标准偏差

69.9065

55.0787

148.4978

87.7890

92.1774

113.3266

相对标准偏差（CV％）

1.96

1.39

3.30

6.52

4.37

5.76

结论：

各验证单位的室内相对标准偏差（CV％）分别为

样品中泛酸含量水平1时为：

0.45％～1.96％；

样品中泛酸含量水平2时为：

1.03％～1.39％；

样品中泛酸含量水平3时为：

1.62％～3.34％；

样品中泛酸含量水平4时为：

0.74％～6.52％；

样品中泛酸含量水平5时为：

2.28％～4.37％；

样品中泛酸含量水平6时为：

1.25％～5.76％；

1.5.2方法的实验室间精密度

3家验证单位实验室间精密度如下表

实验室

水平1（µg/100g）

水平2（µg/100g）

水平3（µg/100g）

水平4（µg/100g）

水平5（µg/100g）

水平6（µg/100g）

国家乳制品质量监督检验中心

3742.57

4184.38

4677.23

1425.13

2271.23

2228.48

湖南亚华乳业有限公司

3720.25

3714.22

4455.52

1382.46

2235.16

2180.12

北京世纪维他生物技术有限公司

3557.75

3952.50

4502.75

1345.75

2108.00

1966.25

平均值

3673.52

3950.37

4545.17

1384.45

2204.80

2124.95

标准偏差

100.88

235.09

116.78

39.73

85.75

139.55

相对标准偏差（CV/%）

2.7461

5.9510

2.5694

2.8695

3.8891

6.5672

结论：

各验证单位的实验室间相对标准偏差（CV％）分别为

样品中泛酸含量水平1时：

2.75％；

样品中泛酸含量水平2时：

5.95％；

样品中泛酸含量水平3时：

2.57％；

样品中泛酸含量水平4时：

2.87％；

样品中泛酸含量水平5时：

3.89％；

样品中泛酸含量水平6时：

6.57％；

总结：

上述多种实验数据表明：

本标准经修订后操作更加简便，准确性好，精密度高，完全适应现代婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸测定的需要。

附1：

泛酸测定结果的重现性、复现性限的计算

依据GBT6379.2-2004《测量方法与结果的准确度第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》计算

表1原始记录：

米粉泛酸测定结果（µg/100g）

实验室i

重复次数

水平1

水平2

水平3

水平4

水平5

水平6

1

（国家乳制品质量监督检验中心）

1

3769.7

4140.7

4630.6

1422.1

2351.6

2220.5

2

3753.7

4130.0

4661.5

1410.2

2254.3

2262.8

3

3723.0

4183.0

4609.1

1439.8

2295.1

2201.4

4

3739.1

4201.4

4674.6

1428.2

2314.1

2256.1

5

3741.2

4245.1

4663.4

1432.1

2214.1

2195.0

6

3728.7

4206.1

4824.2

1418.4

2198.2

2235.1

2

（湖南亚华乳业有限责任公司）

1

3726.9

3683.0

4574.8

1439.4

2288.7

2201.1

2

3695.6

3820.3

4369.2

1385.9

2275.5

2253.1

3

3759.5

3672.5

4338.0

1363.9

2263.2

2150.1

4

3705.3

3714.0

4265.8

1342.1

2221.0

2200.9

5

3701.9

3726.6

4322.9

1349.6

2167.3

2138.6

6

3765.9

3690.7

4607.3

1357.9

2152.6

2237.3

7

3700.3

3739.8

4562.7

1389.9

2243.9

2253.8

8

3706.6

3666.9

4603.5

1431.0

2269.1

2006.1

3

（北京世纪维他生物技术有限公司）

1

3600

3948

4422

1237

2029

2079

2

3535

3883

4699

1346

2147

2042

3

3626

4017

4530

1452

2036

1906

4

3470

3962

4360

1348

2220

1838

表2泛酸含量的单元平均值（µg/100g）

实验室i

水平j

1

2

3

4

5

6

yij

nij

yij

nij

yij

nij

yij

nij

yij

nij

yij

nij

1

3742.57

6

4184.38

6

4677.23

6

1425.13

6

2271.23

6

2228.48

6

2

3720.25

8

3714.22

8

4455.52

8

1382.46

8

2235.16

8

2180.12

8

3

3557.75*

4

3952.50

4

4502.75

4

1345.75*

4

2108.00

4

1966.25

4

表3泛酸含量的标准差

实验室i

水平j

1

2

3

4

5

6

sij

nij

sij

nij

sij

nij

sij

nij

sij

nij

sij

nij

1

17.0246

6

43.1634

6

75.9761

6

10.4937

6

59.5832

6

27.9373

6

2

27.8282

8

50.0974

8

144.1697

8

36.4923

8

50.8921

8

82.6390

8

3

69.9065*

4

55.0787

4

148.4978

4

87.7890*

4

92.1774

4

113.3266

4

一、一致性和离群值的检查

p=3,n=8,柯克伦检验1%临界值为0.793，5%临界值为0.707。

对水平1，实验室3的s最大：

ΣS2=4886.9187;检验统计量值=0.8212

对水平2，实验室3的s最大：

ΣS2=3033.6632;检验统计量值=0.4096

对水平3，实验室3的s最大：

ΣS2=22051.5966;检验统计量值=0.4537

对水平4，实验室3的s最大：

ΣS2=7706.9085;检验统计量值=0.8424

对水平5，实验室3的s最大：

ΣS2=8496.6731;检验统计量值=0.5805

对水平6，实验室3的s最大：

ΣS2=12842.9183;检验统计量值=0.6279

这表明水平1--6通过柯克伦检验后，其检验统计量值大于1%临界值0.793的水平单元为水平1和水平4中的第三实验室，因此将其视为离群值，不参与以下计算，将这一测试结果排除后，把其余实验室再进行柯克伦检验，结果表明其检验统计量值小于5%临界值，即没有离群值和歧离值，因此在剔除离群值后其所有数据均可参与计算。

（离群值用*标出）

二、mj,srj和sRj的计算

根据GB/T6379.2-2004中7.4.4和7.4.5中所定义的诸方差计算

水平1：

实验室数p=2

T1=Σniyi=52217.42

T2=Σni（y）2=194763061.7294

T3=Σni=14

T4=Σni2=100

T5=Σ（ni-1）st2=6870.04603

T5

sr2=————=572.50384

T3-p

T2T3-T12T3（p-1）

sL2=[————-sr2][————]=165.60106

T3（p-1）T32-T4

sR2=sL2+sr2=27.1680

T1

mj=——=3731.41

T3

同理，分别计算水平2、3、4、5的：

mjsR2sr2列于表5

二、精密度与m的关系

对表5种的数据进行检查，没有显示出它们与m任何依赖关系。

因而可以用他们的平均值。

表5泛酸的mjsrjsRj计算值

水平j

Pj

mj

srj

sRj

1

2

3731.41

65.966

63.016

2

3

3950.37

68.620

266.337

3

3

4545.17

73.810

140.525

4

2

1403.80

40.425

48.221

5

3

2204.80

51.601

91.516

6

3

2124.95

50.779

136.101

结论

测量方法精密度（以质量的百分数表示）可引述如下：

重复性标准差：

sr=61.623（μg/100g）

重复性限为：

r=2.8×sr=172.545（μg/100g）；

再现性标准差：

sR=123.857（μg/100g）

再现性限为：

R=2.8×sR=346.779（μg/100g）

附录2标样及试样泛酸色谱图

图1、泛酸标准样品色谱图（国家乳制品质检中心）

图2、婴幼儿奶粉泛酸色谱图（国家乳制品质检中心）

图3、婴幼儿米粉泛酸色谱图（国家乳制品质检中心）

参考文献

[1]GB10767-1997《婴幼儿配方粉及婴幼儿补充谷粉通用技术条件》

[2]GB/T5413.17-1997《婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定》

[3]GB10765-1997《婴幼儿配方乳品Ⅰ》

[4]GB10769-1997《婴幼儿断奶期的辅助食品》

[5]GB/T2001.4-2001标准编写规则，第4部分：

化学分析法