分子生物学实验.docx
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分子生物学实验
微量移液器的使用方法
质粒DNA(pBlueScriptII(SK))的碱法提取
大肠杆菌总DNA的抽提
质粒和总DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测
重组片段的回收
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
重组片段的连接和转化
蓝色白色菌落法筛选重组子及重组比例的计算
PCR(设计实验)
分子生物学实验计划
第一部分实验:
熟悉实验室环境
实验一微量移液器的使用方法
第二部分实验:
蓝色白色菌落筛选重组子
实验二质粒DNA(pBlueScriptII(SK))的碱法提取
实验三大肠杆菌总DNA的抽提
实验四质粒和总DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测
实验五重组片段的回收
实验六CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
实验七重组片段的连接和转化
实验八蓝色白色菌落法筛选重组子及重组比例的计算
第三部分实验:
设计实验
实验九PCR
第一部分实验:
熟悉实验室环境
实验一微量移液器的使用方法
实验原理:
微量移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精密取液装置(俗称枪),基本原理是依靠装置内活塞的上下移动,气活塞的移动距离是由调节轮控制螺杆结构实现的,推动按钮带动推动杆使活塞向下移动,排除活塞腔内的气体。
松手后,活塞在复位弹簧的作用下恢复原位,从而完成一次吸液过程。
实验步骤:
1、设定好移液器的读数(1µl,5µl,10µl),按到第一档,垂直进入液面下几毫米;
2、缓慢松开控制按钮,否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少;
3、将液体缓慢点在做好标记的滤纸片上,操作时先按到第一档,稍微停顿1sec后,待剩余液体聚集后,再按到第二档将剩余液体全部压出。
读数的设定:
P10 0.5~10;P20 2~20;
P100 20~100;P200 50~200;
P1000 200~1,000;P5000 1,000~5,000。
图1:
微量移液器的使用方法
思考题:
1.要取265µldH2O,请问如何选择移液器?
第二部分实验蓝色白色菌落筛选重组子
E.coli总DNA
BamHI酶切,回收片段
质粒
BamHI酶切,回收片段
T4连接酶连接
转化大肠杆菌细胞
蓝色白色菌落筛选
图2:
第二部分实验总设计图
实验二质粒(pBlueScriptIISK)DNA的碱法提取
实验目的:
掌握质粒小量碱法抽提的基本原理和基本步骤。
实验原理:
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
实验步骤:
(在实验前一天晚上,由杨老师在5mlLB培养基中接种大肠杆菌单菌落培养)。
1、取3ml培养物倒入微量离心管中,12000rpm离心1min,尽量去除上清液。
2、将细菌沉淀悬浮于100μl溶液I中,充分混匀。
3、加200μl溶液II(新鲜配制),盖紧管口,轻轻颠倒试管数次,混匀样品。
4、加入150μl溶液III,盖紧管口,迅速颠倒数次混匀,12000rpm,离心5min,将上清转至另一离心管中。
5、向上清中加入等体氯仿(Caution:
氯仿对移液器有很强的腐蚀作用。
),反复混匀,12000rpm离心5min,将上清转至另一离心管中(Note:
考虑酚有挥发性,且毒性大,在这不用)。
6、向上清中加入2倍体积无水乙醇,混匀后-20℃放置30min,12000rpm离心5min,弃上清,吸干离心管中的液体。
7、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,颠倒数次混匀并12000rpm离心1min,去除上清,用枪头将剩余液体尽量吸干,然后打开离心管的盖子,让样品在37℃培养箱中自然风干(Caution:
乙醇一定要去除干净,因为它会在以后的操作中影响酶的活性)。
8、加25μlTE缓冲液(其中含有20μg/ml的胰RNA酶),充分溶解DNA。
样品放入-20°C冰箱保存待用。
附1.各溶液的配方:
溶液I:
50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,pH8.0;
溶液II:
0.2NNaOH/1%SDS;
溶液III:
3M醋酸钾/2M醋酸
思考题:
1.碱法抽提质粒时,NaOH的作用是什么?
实验三大肠杆菌总DNA的抽提
实验目的:
掌握细菌基因组DNA抽提的方法。
实验原理:
制备DNA的过程中是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是通过SDS和蛋白酶K裂解细胞并消化蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
细菌基因组DNA通常是个很大的环状DNA,而在抽提过程中,不可避免的机械剪切力必将切断DNA,要尽可能地温和操作,减少剪切力,减少切断DNA分子的可能性;另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。
实验步骤:
(在实验前一天晚上,接E.coliDH5alpha到LB培养基中培养。
)1、10000rpm离心3min收集3ml新鲜的菌体(两次离心),尽量去除上清。
2、沉淀中加破菌缓冲液300μl(200mMTris-HCl(PH8.0),250mMNaCl,25mMEDTA,0.05g/LSDS;可以不用溶菌酶、与蛋白酶K),然后60℃,1hr温育,每隔一段时间拿出来轻弹一下,使样品混合均匀。
3、-20℃预冷5min,12000rpm离心10min。
4、取上清液加等体积饱合酚混匀,12000rpm,5min离心取上清液。
5、上清液再加等体积饱合酚:
氯仿=1:
1混匀,12000rpm离心5min,取上清液。
(Note:
4-5步骤,因为酚有毒,本实验考虑只是提取总DNA,对其纯度要求不高,可以考虑不用做这两步。
)6、将上清液转移到一个新的小离心管中,加等体积氯仿混匀,12000rpm,5min离心,将上清液转移到一个新的小离心管中。
7、向上清中加入2倍体积无水乙醇,并加3MNaAc(pH5.2)90μl混匀,-20℃预冷30min,12000rpm离心10min,弃上清,吸干离心管中的液体。
8.用1ml70%乙醇重悬沉淀,12000rpm,5min离心后尽量去除上清,然后打开离心管的盖子,让样品在37℃培养箱中自然风干(Caution:
乙醇一定要去除干净,因为它会在以后的操作中影响酶的活性)。
9.将干燥好的DNA样品溶于25μl的TE。
思考题:
1.用本方法抽提的总DNA是否是完整的E.coli基因组,为什么?
实验四质粒和总DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测
实验目的:
掌握DNA酶切方法和琼脂糖凝胶电泳的原理和操作要点。
实验原理:
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
BamHI的识别位点是:
5‘-G↓GATCC-3’
3‘-CCTAG↑G-5’
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是它兼有“分子筛”和“电荷效应”的双重作用。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,长度相同的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
同时,琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
实验步骤:
1、在灭菌的微量离心管中依次添加以下样品,混匀后放入37°C培养箱中保温2-3hr。
dH2O12μl
DNA15μl
10XBuffer3μl
BamHI1μl
总反应体系30μl。
2、称取0.7克琼脂糖,加入100mlTAE缓冲液,微波炉加热溶解(注意此处应该不能看到颗粒物质,在溶液中,一般应沸腾三次),制备0.7%琼脂糖凝胶。
3、待琼脂糖凝胶不烫手时,加入7μl的goldenview(Caution:
该染料可能对人体有害)。
4、封好胶板,插入梳子,制备凝胶。
5、将5μlDNA样品与1μlloadingBuffer(上样缓冲液)混合,加入到点样孔中,在最后一个孔中加入分子量标记(marker)。
6、80V稳压电泳,直至溴酚蓝泳动到离上样孔约2-3cm的位置。
7、带上手套,将胶放入到紫外灯(360nm或254nm)下观察电泳结果,并照相记录实验结果(Caution:
UV有诱变作用。
)。
图3:
琼脂糖凝胶的制备和样品的loading。
B.
A.
8kb
10kb
图4:
A.λ-EcoT14分子量标记的带型图;B.电泳图的标注方式。
思考题:
1.为什么未酶切的质粒样品会出现2-3条带?
2.上样缓冲液的作用是什么?
实验五重组片段的回收
实验目的:
掌握乙醇沉淀和胶回收两种不同的DNA回收方法。
实验原理:
利用融胶液断裂琼脂糖的多糖键,从而使凝胶完全融化,同时采用了硅胶膜特异性吸附DNA,使DNA结合到纯化柱上同时在一定条件下又能被充分洗脱下来,从而实现DNA的快速纯化。
实验步骤:
1、制备回收用的琼脂糖凝胶。
2、将待纯化的DNA样品(质粒酶切后的样品)加到胶上进行电泳。
3、在紫外灯下用干净的刀片切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶条(速度要快,UV有打断DNA的作用),将其装入离心管中,估计其体积。
4、加入3倍凝胶体积的BufferDE-A。
5、悬浮均匀后于75°C加热8min,每隔2~3min混合一次,直至凝胶块完全融化。
6、按BufferDE-A体积的50%加入BufferDE-B,混合均匀。
7、将DNA-prepTube置于2mlMicrofugeTube中,将步骤6中的混合液移入DNA-prepTube中,5500rpm离心1min。
8、弃滤液,将DNA-prepTube置回到原2mlMicrofugeTube中,加入500μlBufferW1,5500rpm离心1min。
9、弃滤液,将DNA-prepTube置回到原2mlMicrofugeTube中,加入500μlBufferW2,5500rpm离心1min,弃滤液,以同样的方法再用500μlBufferW2洗涤一次。
10、弃滤液,将DNA-prepTube置于原2mlMicrofugeTube中,12000rpm离心1min
11、将DNA-prepTube置于一洁净的1.5mlMicrofugeTube中,在silica膜中央加入15μldH2O,室温静置1min,12000rpm离心1min洗脱DNA,收集离心后的洗脱液。
思考题:
1.为什么DNA需要回收?
2.回收胶和检测胶有什么不一样?
实验六CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
实验目的:
了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
实验原理:
所谓感受态是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,该生长阶段的细菌能接受外源DNA而不将其降解。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论,形成的机理有两种假说:
1.局部原生质体化假说:
细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA分子能通过质膜进细胞;2.酶受体假说:
感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点,使DNA分子能进入细胞。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法等,RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入无菌甘油至总体积15%,于-70℃保存半年之久,因此CaCl2法为使用更广泛。
实验步骤:
1、取出保存的大肠杆菌DH5α菌株在LB平板上划线,置37°C过夜培养;
2、挑取一活化好的DH5α单菌落至盛有50mlLB液体培养基的三角瓶中;
3、37°C、300rpm摇床培养3hr,使其OD600=0.6~0.8;(预实验)
4、将培养好的菌液分装到无菌1.5ml离心管中,冰上放置10min,于4°C,4000rpm离心4min收集菌体;
5、弃上清,加入1.5ml0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体,轻轻摇匀,置冰上放置30min;
6、再次4000rpm离心4min收集菌体;
7、弃上清,加入200μl0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体,摇匀后置冰上或冰箱中放置待用。
*在整个过程中注意无菌操作。
思考题:
1.感受态制备中的技术要点有哪些?
实验七重组片段的连接和转化
实验目的:
了解重组子构建的方法并掌握大肠杆菌转化的方法。
实验原理:
T4DNA连接酶(T4DNALigase)可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合,该催化反应需ATP作为辅助因子。
转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化过程中,受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(即带有异源DNA分子的受体细胞)。
实验步骤:
1.将经BamHI处理过的pBlueScriptIISK质粒和回收的目的DNA片段进行连接
线性质粒2μl
目的DNA片段6.5μl
10X连接Buffer1μl
T4DNA连接酶0.5μl
总体积10μl,16°C水浴,反应过夜。
2、将酶连产物用无菌枪头加入到100μl感受态细胞悬液中,轻轻旋转混匀,冰上放置30min;
3、将上述离心管置于42°C热激60sec后立即冰上放置2-3min;
4、向离心管中加入0.8mlLB培养基,然后置37°C摇床180rpm复苏45~60min;
5、样品在4000rpm离心2min,去掉700μl上清,然后将剩下的样品混匀并涂布于添加有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上。
6、平板在37°C倒置培养14~18hr后观察结果。
附1:
X-gal/IPTG平板的制备
在事先制备好的含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板表面加40μlX-gal(20㎎/ml)储藏液,和4μlIPTG(200㎎/ml),用无菌推子涂匀,置于37℃3-4小时,使液体被充分吸收,备用。
思考题:
1.经过BamHI酶切的pBlueScriptIISK质粒片段和BamHI酶切的大肠杆菌基因组片段混合后,用T4DNA连接酶进行连接时可以发生哪几种方式的连接,哪种方式占主导?
2.
实验八蓝色白色菌落法筛选重组子及重组比例的计算
实验目的:
了解alpha-互补的原理,掌握重组率的计算方法。
实验原理:
蓝白斑筛选的基因工程大肠杆菌菌株为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株,宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变,造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽(即α肽链),从而不具有生物活性,即无法作用于X-gal产生蓝色物质。
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因,lacz'中包括:
一段β-半乳糖苷酶的启动子;编码α肽链的区段;一个多克隆位点(MCS)。
MCS位于编码α肽链的区段中,是外源DNA的选择性插入位点,但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶,但当菌体中含有带lacz'的质粒后,质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补,具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力,这种现象即α-互补。
实验步骤:
1、计算平板上的总菌落数。
2、计算平板上的白色菌落数。
3、计算重组效率。
第三部分实验:
设计创新实验
实验九:
PCR扩增目的DNA
实验目的:
掌握PCR过程中引物的设计,PCR体系的设定,以及PCR产物的检测。
引物设计的原理:
以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准,确定待扩增片段两侧的引物序列。
按5’→3’方向,照抄模板的序列,先写下5’端引物的序列;然后根据模板3’的序列,写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列,即为3’引物的序列。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性;产物不能形成二级结构;引物长度一般在15~30碱基之间; G+C含量在40%~60%之间;碱基要随机分布; 引物5′端可以修饰;引物3′端不可修饰。
实验过程:
1)根据下面给出的pBlueScriptIISK质粒DNA序列,8个同学一组,自己设计引物,
2)送公司合成引物。
3)设定PCR体系,扩增目的DNA序列。
4)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
附1:
PCR的原理和反应体系:
图5:
PCR的基本原理
反应体系:
forward引物(10µM)20pmol
reverse引物(10µM)20pmol
dNTP(2.5mM)4µl
10XBuffer5µl
Template0.1-2µg
TaqDNA聚合酶2.5U
dH2Otototalvolume50µl
附2:
pBlueScriptIISK质粒的序列:
1cacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcag
61ctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagac
121cgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtgga
181ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatc
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301gagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaa
361gaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaac
421caccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggct
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661gccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcctgcagcccggggg
721atccactagttctagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagt
781gagggttaatttcgagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgtt
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1561cagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggt
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