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RNA沉默机制研究进展
RNA沉默机制研究进展
RNA沉默机制的研究主要集中在遗传和生化方面。
遗传方面,各研究小组选择遗传突变子的筛选策略,即筛选RNA干涉功能丧失的突变基因。
目前在拟南芥中已发现了SGS1、SGS2、SGS3以及SDE1、SDE2、SDE3和SDE4等多个参与RNA干涉作用的基因,(Elmayan,1998;Dalmay,2000)而在链孢霉中发现产生基因消除所必需的基因QDE1、QDE2和QDE3(Tijsterman,2002)基因序列分析发现,不同生物中RNA干涉相关的必需基因互为同源基因。
生化方面,Hamilton等人率先在发生PTGS的西红柿中检测到了与被沉默基因同源的、大小约为25nt的小片段RNA分子,而未发生PTGS的西红柿却没有检测到这种小分子。
(Hamilton,1999)。
Zamore等在果蝇RNA干涉实验中观察到,双链RNA首先被降解成21~23nt的小片段,然后相应的mRNA也在与双链RNA同源的区段内,按照同样的间隔被降解成21~23nt的小片段(Zamore,2000)。
RNAi作用分子
目前对于RNA干涉中起作用的RNA小分子已有了比较透彻的研究,这些小分子目前被分为以下几类:
一种是小干涉RNA分子(smallinterferingRNAs,siRNAs);另一种是微RNA分子(MicroRNAs,miRNAs);这是两种最主要的作用小分子;最近又有两类参与RNA干涉作用的小分子被发现,分别是微小非编码RNA(Tinynon-codingRNAs,tncRNAs)和小调控RNA分子(SmallmodulatoryRNA,smRNAs)(VictorAmbros,2003;Kuwabara,2004)。
tncRNAs是线虫基因组中编码的一类约在20-22nt的RNA分子,它们在进化上并不保守,功能上可能与发育调控有关,具体功能目前还未有报道(VictorAmbros,2003)。
smRNAs是2004年初报道的在老鼠中发现的一种RNA小分子,只在成熟神经细胞中调控神经细胞特异基因表达。
(Kuwabara,2004)
siRNAs小分子和miRNAs小分子是RNA干涉作用中两种主要的小分子。
两者既有不同点,又有许多相似之处。
siRNAs是由于Dicer酶类酶切长的双链RNA前体产生的,前体来源于病毒复制本、细胞RNA-依赖的RNA聚合酶(cellularRNA-dependentRNApolymerases,RDRPs)作用的结果或者是基因组内反向重复片段转录的结果,5’端带磷酸基团、3’端带羟基、大小约为21-25nt的RNA分子;miRNAs分子在存在形式上基本与siRNAs分子相同,大小约为19-25nt的RNA分子;但其与siRNAs的关键不同点在于它的来源,它是Dicer酶类加工RNA聚合酶II从内源非编码蛋白基因转录产生的高度结构化的RNA前体分子而成。
但两者均依赖于RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplexes,RISC)中的Argonaute蛋白的活性进行(He,2004)。
两者的区别:
1)siRNAs以双链形式存在,而成熟的miRNAs是以单链形式存在的;
2)miRNAs参与正常情况下的生长发育基因调控,在大多数的多细胞生物基因组中都有编码,它们沉默蛋白合成阶段的基因,而siRNAs不参与生物体的正常生长,只有在病毒或其它双链RNA诱导的情况下才产生,它们通过与互补序列的精确配对而促进mRNA的切割或招募抑制蛋白、或直接指导DNA的修饰而起作用;
3)Dicer酶对两类RNA分子的加工过程不同;多细胞动物的miRNAs分子是通过Drosha和DicerRNaseIII在细胞核及细胞质分两步分别发生的;而siRNAs则是仅由Dicer酶类作用,而且是在细胞质中加工完成的。
4)miRNAs在多细胞动物界或在有关的植物品种中是保守的,而siRNAs序列是完全多样的,在作用方式上,miRNAs并不需要与它们的靶目标完全匹配,而siRNAs则需要与它们的靶目标完美匹配。
((Dmitry,2004;Michael,2005)
所有的证据均支持两种小分子是以双链生成的,但在功能复合体中以单链形式集累,最有说服力的证据表明miRNAs分子最初含有两条链的证据是miRNAs的生物合成在植物及多细胞动物中均可被病毒蛋白p19所阻断,而p19蛋白结合双链的RNA小分子结构但并不结合单链的RNA小分子((Ye,2003;Lakatos,2004),那么p19蛋白抑制miRNAs功能的最简单解释就是miRNAs分子最初是以双链形式短暂存在的。
RNAi效应复合体的组装
RISC组装的关键步骤是将siRNAs和miRNAs小分子两条链中的一条选择进入该复合体,目前RISC复合体的体外研究只在Drosohaila得到研究。
(Lee,2004)
果蝇中,siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶类进行加工的,Dcr-1酶产生miRNAs小分子而Dcr-2酶产生siRNAs小分子,Dcr-2酶还指导siRNAs小分子的一条链进入RISC复合体。
人类中的Dicer酶也可能有指导siRNAs小分子进入RISC复合体的功能,因为Dicer酶缺失的人类细胞中siRNAs小分子并不能诱导产生RNA沉默。
(Doi,2003)不同的是,siRNAs小分子可以在Dicer酶敲除的ES细胞中行使降低靶基因表达的功能。
(Kanellopoulou,2005)
目前提出两条类似的DrosohailaRISC组装步骤(Pham,2004;Tomari,2004),而Tomari,2005将两条类似途径整合,如图1-1。
Tomari,2004a提出,RISC的组装开始于双链siRNAs小分子整合到未确定的蛋白形成复合体B,在体外,复合体B是RISC装载复合体(RISC-loadingcomplex,RLC;formerly“complexA”)的动力学前体,尽管复合体B作为RISC组装的早期中间体的途径还不是很完整,但RLC在将siRNAs小分子装载到RISC中的关键作用已得到有力支持(Tomari,2004b)。
RLC含有Dcr-2蛋白和它的合作者R2D2蛋白,而后者具有前后相近的dsRNA结合结构域,而这两个蛋白质对于体内的RNA沉默中的RLC的形成及siRNAs小分子解链都是必需的。
(Liu,2003)RLC既含有双链的siRNAs小分子,也含有小量的单链siRNAs小分子,这说明双链siRNAs小分子的解链始于这个复合体。
RLC中的siRNAs小分子通过Dcr-2蛋白和RICS前体(holo-RISC)的Ago蛋白的相互作用而将RICS前体征募过来形成RISC复合体。
Pham,2004提出的途径与此类似。
RISC功能
小RNA分子进入RISC复合体后,小RNA分子至少有三种不同的沉默方式。
在RNAi途径中,小RNA分子介导RISC切割靶RNA,RISC的切割需要Mg2+存在,但此反应可被硫代磷酸酯在易断裂的磷酸基团处抑制,切割产物具有5’端磷酸基团、3’端羟基。
该反应被认为是通过Argonaute蛋白的亚家族的Piwi结构域催化的,该结构域是Mg2+依赖的RNaseH的结构同系物,而RNaseH切割RNA-DNA杂合体中的RNA链(Song,2003;2004)。
不同于RNaseH,每一个具有切割能力的RISC只在其靶RNA目标的唯一磷酸二酯键处进行断裂(即易断裂的磷酸基团处)(Elbashir,2001)。
RISC是一种多转换酶类(multipleturnoverenzyme),Argonaute蛋白质是RISC中的核心组分。
小RNA分子将RISC引导到靶RNA分子,靶目标被切割后,小RNA分子完封不动地离开RISC(MartinezandTuschl,2004)。
目前研究表明将RISC绑定到靶RNA分子上的能量来源于小RNA分子5'端(Haley,2004;Doench,2004),这是siRNAs小分子和miRNAs小分子与反义寡核苷酸的本质不同之处,后者所有的碱基对特异性具有相等的贡献。
倘若多个小RNA分子结合到靶目标上,siRNAs小分子和miRNAs小分子的3'端与靶RNA分子的完全配对对于翻译抑制及靶mRNA破坏并不是必需的,从技术角度说,绝大多数小RNA分子不但下调它们的目标靶mRNA分子,而且减少其它与小RNA分子有部分互补序列的mRNA分子的表达。
(Jackson,2003)
在翻译抑抑制途径,小RNA分子介导RISC结合到mRNA分子并抑制其翻译成蛋白质而不是切割mRNA分子。
多细胞动物中的miRNAs小分子主要是,当然并不总是,介导翻译抑制而不是切割它们。
相对而言,大多数植物miRNAs小分子直接指导靶mRNA分子的切割。
在很多详细研究的多细胞动物翻译抑制例子中,翻译抑制是靶mRNA分子的3'端非翻译区位点对小RNA分子指导的RISC结合的反应。
实际上,mRNA分子3'端非翻译区的多个候选结合位点可以作为预测mRNA分子是否受小RNA分子调控的指示标记。
(Lewis,2003)
小RNA分子还可以指导抑制性异染色质的形成。
到目前为止,对这条途径相关的唯一复合体的描述是关于Schizosaccharomycespombe的RITS(aRISC–likecomplexthatcontainssiRNA),关于RITS如何指导组蛋白的修饰从而促进抑制性异染色质的形成的机制还不清楚。
小RNA分子通过DNA甲基化而抑制翻译目前在多细胞动物中也有报道。
(Kawasaki,2004)
植物中至少有三种RNA沉默途径(DavidBaulcombe,2004),在这些途径中,沉默信号可以在细胞间扩增及传导,甚至可以通过反馈机制自我调控。
这些途径的不同生物学作用已经建立,包括防御病毒、调控基因表达以及与染色质异缩为异染色质有关。
三种途径均包括通过具有RNaseIII结构域的Dicer酶将双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)剪切成21-26ntRNA分子。
这些小RNA分子被称为小干涉RNA(shortinterferingRNAs,siRNA)或微RNA分子(microRNAs,miRNAs)。
三种途径之一是细胞质siRNA沉默(Hamilton,1999)。
这条途径可能在病毒感染植物细胞中起重要作用,其中dsRNA可能作为复制媒介(replicationintermediate)或具有单链病毒RNA的二级结构特点。
在植物DNA病毒中,dsRNA可能通过重叠互补转录本的退火而形成。
第二个途径是通过miRNAs沉默内源mRNA。
这些miRNAs分子通过与特异mRNA的碱基配对而负调控基因表达,导致RNA剪切或蛋白翻译的停滞。
miRNAs可能来源于具有部分双链区域的反向重复前体RNA分子,它们通过与互补的单链mRNA相互作用而起作用。
植物中RNA沉默的第三条途径是通过DNA甲基化抑制转录而起作用。
这条途径的最初证据是在植物中发现转基因及病毒RNA指导特异的核苷酸DNA甲基化(Mette,2000;Jones,2001)。
最近研究发现植物中siRNA指导的DNA甲基化与组蛋白修饰有关。
(Zilberman,2003)
Rrgonaute(Ago)蛋白质参与RNA沉默的所有三种途径。
拟南芥中,AGO1突变体对细胞质siRNA沉默和miRNAs沉默这两个途径是缺失的,而AGO4突变体则对染色质沉默途径有所伤害。
(Zilberman,2003)AGO蛋白的中心作用可能作为沉默效应复合体(silencingeffectorcomplexes)的成员而发挥作用,而后者结合siRNA和miRNAs分子。
Dicer基因家族在拟南芥中只有四处成员(Schauer,2002),其中的两个成员的功能已得到较好的确定。
DCL1(Dicer-like1)与miRNAs的生物合成有关。
(Papp,2003;Finnegan,2003;Xie,2004)DCL3产生逆转录因子和转座子,与染色质沉默有关。
(Xie,2004)DCL3的产物对应于与一类转座子相关的siRNA,而且产物相对于典型的DCL1产物而言较长(24个核苷酸而不是通常的21个核苷酸)(Hamilton,2002;Tang,2002)家族中的另外两个成员的功能目前还没有得到很好的鉴定。
在C.elegans,fungi和植物中,RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerases,RDRsorRDRP)在细胞质及染色质沉默途径中发挥作用(Sijen,2001;Smardon,2000;Cogoni,1999;Dalmay,2000)。
拟南芥中沉默转基因和病毒的细胞质RNA沉默途径要求RDR1和RDR6两个直向同源基因,然而这两个蛋白对不同的病毒RNA有特异性,RDR6突变体对黄瓜花叶病毒超敏感而对烟草花叶病毒并不敏感(Dalmay,2001),而降低RDR1表达水平的烟草植株表现出对烟草花叶病毒敏感。
(Xie,2001)
植物和多细胞动物的miRNA途径基本上是一致的;都是由Dicer产生的20-22nt单链miRNAs分子作用,两者都依赖于Ago蛋白的作用。
然而多细胞动物的miRNAs分子是通过Drosha和DicerRNaseIII在细胞核及细胞质分两步分别发生的。
(Bartel,2004)而植物中的miRNAs分子只是由Dicer酶加工的,并且可能该步骤只是在细胞核中发生。
(Papp,2003)与这两种加工形式不同相对应的是,一种dsRNA结合蛋白,HYL1,只对植物miRNA途径特异。
(Han,2004;Vazquez,2004)两者更主要的不同点在于:
植物的miRNA分子与它们的靶RNA分子完美配对并且用RNA剪切而不是翻译抑制(translationsuppression)作为主要的沉默机制。
(Rhoades,2002;Jones-Rhoades,2004;Llave,2002)动物的miRNA分子通常是靶向到mRNA分子的3’非翻译区(untranslatedregin,UTR),而植物miRNA分子则是靶向到编码区甚至在5’非翻译区。
(Sunkar,2005)
转录后基因沉默(PTGS,post-transcriptionalgenesilencing)-最初被认为仅限于矮牵牛花和其它一些植物中的奇异现象,是目前分子生物学研究中一个最热门的话题。
过去几年中,科研工作者已明确转录后基因沉默现象普遍存在于动、植物中,在机体防御病毒入侵和转座子沉默效应中起着重要作用。
但是最激动人心的是转录后基因沉默现象的技术应用,即在多种有机体中应用核糖核酸干扰(RNAinterfere,RNAi)技术进行特异性的基因剔除以研究相应的基因功能。
那么核糖核酸干扰现象是如何被发现?
它是怎样工作的?
科研工作者怎样把它应用到功能基因组学的研究中呢?
10多年前,RichJorgensan和他的同事在矮牵牛花中发现一种奇怪的现象。
他们尝试把由一强有力启动子控制的基因pigment-produing导入矮牵牛花以加深花的紫色,结果不但颜色未加深,许多花呈现杂色甚至白色。
RichJorgensan把这种现象称为"共抑制",因为外源性导入基因和内源性具有相似功能基因的表达都被抑制了。
当时人们不知道这是一种转录后基因沉默。
双链核糖核酸能导致转录后基因沉默首先来自于对线虫的研究。
1995年Guo和Kewphues试图用反义核糖核酸来阻断Par-1基因的表达以研究其功能。
确实反义核糖核酸抑制了基因表达,出乎意料的是用作阴性对照的正义核糖核酸也抑制了基因表达。
该结果一直让人迷惑不解,直至三年后Fire和Mello进行了另一实验才真正提出双链核糖核酸能导致转录后基因沉默的理论。
Fire和Mello发现把反义核糖核酸和正义核糖核酸的混合物导入线虫后,其抑制效应远远强于单独导入反义核糖核酸或正义核糖核酸的抑制效应。
再后来Baulcomb和Hamilton首先发现是~25nt的核糖核酸能特异性抑制具有相应互补序列的基因表达。
那么核糖核酸干扰(RNAi)是怎样工作的呢?
首先外源导入的双链核糖核酸(dsRNA)被切割为21~23nt的小分子干扰核糖核酸(siRNA)。
Dicer,作为特异性核糖核酸酶家族的一个成员,切割双链核糖核酸为19~23nt小分子干扰核糖核酸(siRNA),这是一个依赖ATP的耗能过程.切割后的siRNA具有3'两个核苷酸TT突出末端。
然后siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体(RISC,RNA-inducedsilencingcomplex)。
该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC。
活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录体,最终导致基因沉默效应。
目前具体的切割机制还不明了,研究表明每个RISC包括单链siRNA和核糖核酸酶RNase。
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由于RNAi强大的基因沉默效应,有人提出了RNAi通路的效应扩增问题。
RNAi通路的效应扩增可能是通过细胞复制外源导入的dsRNA或siRNA本身而实现的。
另外,RISC的多次反复使用也能扩增RNAi的基因沉默效应。
科研工作者已开始RNAi效应增强子和效应抑制子的研究,认为RNAi是机体细胞一种强有力的基因调控机制。
但是在哺乳细胞中外源导入大分子dsRNA(>30nt)常常导致非特异性的基因沉默效应,因为它激活了核糖核酸酶RNaseL而导致非特异性的RNA降解。
相反,siRNA(<30nt)不激活RNaseL,而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应。
该序列特异性方式非常严格,一个碱基的错配会显著降低基因沉默效应。
所以siRNA可以解释如下,它是一种具有3'两个核苷酸TT突出末端的21~23nt大小的双链核糖核酸,作为RNAi的中介分子,通过序列互补配对法则特异性降解目的基因。
siRNA可以经化学合成,比如著名生物学公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面处于世界领先水平,它们既提供即用型siRNA,也提供标记生物素、荧光素和磷酸等的siRNA更方便监测其抑制特异基因表达的效果
siRNA也可以通过体外转录获取。
它相对便宜,尤其适合于同时合成多个siRNA。
虽然理论上说,任何一个具有3'两个核苷酸TT突出末端的19~23nt小分子干扰核糖核酸siRNA都具备序列特异性的基因沉默效应,但是由于位置效应,比如某些序列,尤其是调控序列易被蛋白质附着而阻止RISC的抑制效应,所以科研工作者首先合成2~4个siRNA进行预实验以选定作用最佳者。
RNA专家Ambion公司提供通过体外转录获取siRNA的商品化试剂盒,使这一选择过程简单方便。
目前外源注射和转染是转运siRNA到细胞或机体的主要途经,之后基因沉默效应可以持续数天,同时传至下一代细胞,但终将短时间内消失,因此,最近许多科研小组开发了siRNA的表达质粒,通过瞬时转染或稳定转染以达到在细胞内不断表达siRNA的目的。
有些质粒是表达小发夹结构RNAs(shRNAs,smallhairpinRNAs),在细胞内它被加工处理为siRNA样分子,诱导基因沉默。
该质粒是在polyMeraseⅢ启动子和4~5个碱基T转录终止信号中插入shRAN。
由于polyMeraseⅢ的特性,转录常常在第二个T终止,插入序列折叠成step-loop结构并带有3'-UU突出末端。
该质粒设计是基于线虫、果蝇等中的实验结果,因为其中的基因沉默效应就是通过step-loop而诱导。
另外一种siRNA表达质粒是把编码正义和反义的siRNA分别受控于各自的polyMeraseⅢ启动子。
两种质粒的基因沉默效应相当。
Invivogen公司和Imgenex公司都有操作简单、作用有效的商品化试剂盒提供。
而GeneTherapySystem公司的siRNA构建试剂盒则完全采用了不同的机制。
该试剂盒首先PCR合成目标序列,然后由T7RNA多聚酶进行体外转录,经退火和纯化处理的体外转录dsRNA模板被重组的Dicer酶切割,从而快速、高效地产生大量小分子干扰RNA(siRNAs)。
产生的siRNAs混合物,比单一形式的siRNA更可能导致基因表达沉默。
基于目前的发表文献和一些实验经验,siRNA的设计可遵循以下几点进行1)选择以碱基A或G开始的19~21nt大小的目的mRNA。
因为RNApolyMeraseⅢ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能有效作用。
2)针对目的mRNA一般选择2~4个不同序列,GC含量为30~50%,避免四个碱基T或A的连续序列,避免选择起始MM下游50~100nt、终止MM上游100nt以及5'和3'的非编码区域,BLAST检查设计序列的特异性。
3)设计适当的实验对照,比如设计有1~2个碱基错配的序列,或者是随机变更siRNA的碱基排列顺序。
RNAi的研究刮起了科学界的风暴,siRNA迅速有效抑制特异基因功能的性质促使科研工作者不断深入完善该领域的研究。
RNAi可能是未来发展基因治疗策略的新希望所在。
RNAi技术必将带来功能基因组学的革命
在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:
设计,实验和分析siRNA效应
转录后基因沉默,也称为RNA干扰,是指双链RNA分子阻断或者降低同源基因的表达的现象。
这种现象可能是作为一种抑制病毒感染和转座子跳跃的细胞防御机制(Kettinget.al.,1999;Tabaraet.al.,1999;Jensenet.al.,1999;Ratcliffet.al.,1999)。
在体内,双链RNA被内源的核糖核酸酶降解为21-23个碱基大小的小分子干扰RNA(smallinterferingRNAs,siRNAs)。
这种21—23碱基大小的双链RNA被认为是在哺乳动物细胞中介导RNAi反应的效应物。
RNAi技术已经被广泛应用于线虫和果蝇中基因功能的鉴定。
通常将体外转录得到的长双链RNA引入这类生物中来诱导RNAi,但是这种方法在哺乳动物细胞中行不通,因为长片断的双链RNA在哺乳动物细胞中诱发强烈的抗病毒反应,导致整体基因表达模式的改变,而非特异的基因沉默反应。
最新的实验表明哺乳动物细胞中导入小分子双链RNA则不会引发类似的抗病毒反应,而能够有效的找到特异的目标靶RNA而介导基因沉默。
实验范例
实验说明:
选择哺乳动物细胞中的3个基因:
GAPDH,c-myc,和一个RNA结合蛋白基因La作为研究的目标靶。
相应的mRNAs序列进行分析来确定siRNA设计方案,进行siRNA制备,选择合适方法检测基因抑制的效果。
根据基因的不同区域,每个基因分别设计4组不同的siRNAs。
分别转染Hela细胞并检测目标靶基因表达抑制的程度。
siRNA介导的基因表达抑制的程度分别通过mRNA和蛋白表达水平来检测。
超过一半以上的siRNAs对目的基因的抑制程度超过50%。
siRNAs在目标靶mRNA上不同位置并没有显著影响siRNA的活性,最有效的GAPDHsiRNA被用于在不同哺乳动物细胞类型中评估siRNA的活力。
转录方法制备的siRNA被证实是一种性价比高的方法,通过酶的方法制备的siRNAs至少比化学合成的siRNAs有效10倍。
siRNAs的设计:
siRNAs的设计根据Elbashiret.al.(2001)描述的方法,带3’突出的两个U。
候选的siRNAs序列分别位于mRNA靶的3’5’以及中部,从而验证不同
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