乌司他丁对全肝缺血再灌注肺损伤的保护作用及机制精.docx
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乌司他丁对全肝缺血再灌注肺损伤的保护作用及机制精
乌司他丁对全肝缺血再灌注肺损伤的保护作用及机制
赵东1,杨拔贤1,闫征2,姜春玲1,贾若1
(1.北京大学人民医院麻醉科;2.北京大学人民医院中心实验室)
摘要:
目的:
观察乌司他丁对大鼠全肝缺血再灌注肺损伤的保护作用及其机制探讨。
方法:
建立大鼠全肝缺血再灌注模型,24只SD大鼠随机分为假手术对照组(C组),全肝缺血30min、再灌注60min组(I组)和缺血前10min静脉注射乌司他丁+全肝缺血30min、再灌注60min组(U组)。
检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中总蛋白含量、肺组织干/湿质量比(D/W)、肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)含量,并以RT-PCR方法比较三组大鼠肺组织基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)14mRNA含量。
结果:
(1)与对照组比较,I组大鼠BALF总蛋白和MPO含量明显升高(P<0.05),乌司他丁可以显著抑制这种上升;
(2)与对照组比较,I组和U组大鼠D/W和SOD显著降低(P<0.05),而乌司他丁则可以显著干预其降低程度;(3)与对照组比较,I组和U组大鼠肺组织MMP14mRNA含量显著增加(P<0.05),而乌司他丁则可以显著干预其升高程度。
结论:
大鼠全肝缺血再灌注可产生严重的肺损伤,乌司他丁可以显著减轻肺损伤程度,可能的机制包括抑制肺组织MMP14mRNA的表达。
关键词肺损伤;肝缺血再灌注损伤;乌司他丁;基因表达
Protectiveeffectandmechanismofulinastatinontotalhepaticischemiareperfusionassociatedlunginjuryinrats
ZHAODong,YANGBa-xian,YANZheng,JIANGChun-ling,JIAruo.1.DepartmentofAnesthesiology,PekingUniversityPeople’sHospital,Beijing,100044,China.2.LaboratoryofMolecularBiology,PekingUniversityPeople’sHospital,Beijing,100044,China.
Abstract:
Objective:
Tostudytheroleofulinastatin-aproteaseinhibitorinprotectionoflungdamagefollowingtotalhepaticischemiareperfusioninrat.Methods:
Twenty-fourhealthymaleSDratswererandomlydividedintothreegroups(n=8ineachgroup).GroupCwasservedasshaminjurycontrol,groupIratsunderwent60minutesreperfusionafter30minutestotalhepaticischemiabyclampedthehepatichilumandUTI(ulinastatin,5x104U/kg)wasadministeredtoanimalsingroupU10minutesjustbeforetheocclusion.Theratsweresacrificedatendpointoftheoperationandthelungtissuesweredividedintoseveralpartsfor
(1)pathologicalsection;
(2)pulmonaryMPOandSODactivity;(3)RT-PCRofMMP14mRNA.Inadditiontobronchoalveolarlavagefluidprotein(BALFP)content,andlungdrytowetweightratios(D/W)wererespectivelyexaminedineachgroup.Results:
(1)ComparedtogroupC,contentofMPOinlungtissuesandBALFPweremuchhigheringroupIandUTIcouldreversethistendencysignificantly(P<0.05);
(2)lungD/WandpulmonarySODweremarkedlydecreasedduringhepaticischemiareperfusion,whilethemweresignificantlyincreasedinratspretreatedwithUTI(P<0.05);(3)Inaddition,lungtissuesMMP14mRNAshowedthesamechangeasD/W.Conclusion:
SevereacutelunginjuryaftertotalhepaticischemiareperfusioninratswasattenuatedbyUTIwhichmighthaveapotentialinhibitionruleofMMP14mRNAexpressioninlungtissues.
Keywords:
acutelunginjury;hepaticischemiareperfusioninjury;ulinastatin;geneexpression.
很多手术需要术中完全阻断入肝血流,比如肝脏巨大肿瘤切除、严重肝外伤救治以及肝移植等。
而肝门阻断缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)可以产生严重的多发远隔器官损伤,而肺损伤是术后主要并发症之一[1]。
乌司他丁(ulinastatin、UTI)作为一种广谱的水解酶抑制剂可以减轻氧自由基和炎性因子对机体的损伤。
本研究通过应用大鼠全肝门阻断缺血再灌注损伤模型,观察乌司他丁对肺损伤的保护作用并探讨其机制。
材料与方法
1.实验动物与分组:
健康雄性SD大鼠(中国军事医学科学院动物中心提供)24只,体重220~250g。
随机分为假手术对照组(C组),全肝缺血再灌注组(I组)和乌司他丁处理组(U组),每组8只。
2.动物模型的制备:
大鼠术前禁食12小时,以2%戊巴比妥钠(80mg·kg-1)腹腔注射麻醉后仰卧位固定于操作台,备皮消毒后右侧股静脉置22G套管针补液备给药(微量输液泵以10ml·kg-1·h-1速度补充加温生理盐水)。
取上腹正中切口逐层剪开腹壁各层并显露第一肝门,C组大鼠并不进行阻断,而于显露第一肝门后90min处死并取材相关标本;I组大鼠以无创动脉钳阻断肝蒂30min并于恢复血运60min时处死大鼠;U组于肝门阻断前10min经股静脉给与乌司他丁1ml(广东天普,批号03060803,稀释浓度:
1.25万单位/ml),余操作同I组,而C组和I组大鼠肝门阻断前静脉给与等量生理盐水。
3.检测指标与方法:
(1)左肺BAFL蛋白测定:
术毕放血处死大鼠后从环甲膜处切开皮肤及气管,以14G套管针外壳插管后结扎右侧肺门,4oC冰盐水行左侧支气管肺泡灌洗3次x4ml后收集并3000rpm离心15min,取上清待测总蛋白含量(考马斯亮兰法,南京建成);
(2)右肺上叶形态学观察:
右肺上叶投入10%中性甲醛固定24h,然后依次以50%和75%的酒精固定24h,石蜡包埋切片后行HE染色,5倍光学显微镜下观察形态改变;
(3)右肺中叶肺组织匀浆MPO和SOD含量:
准确称取100-200ug右肺中叶组织,加9倍体积的生理盐水制成10%肺组织匀浆测定髓过氧化物酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)含量(试剂盒购自南京建成);
(4)右肺下叶肺干湿比(D/W):
称取湿重(W)后,在50oC温箱烤48h再称其干重(D),D/W表示肺干湿重比;
(5)MMP14mRNA含量:
取-80oC冻存右肺最下叶组织100mg,Trizol一步法提取总RNA。
以逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定MMP14mRNA相对含量。
以18S作为内参照。
MMP14和18S引物序列均采用Premier3.0软件自行设计并由赛百盛公司合成:
MMP14上游5'-tgggtagcgatgaagtcttc-3',下游5'-agtaaagcagtcgcttgggt-3';18S上游5’-gagctcaccgggttggttttg-3’,下游5’-tacctggttgatcctgccag-3’。
其扩增产物分别为319bp和250bp。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含EB)电泳,紫外灯下观察电泳结果并摄相、测定灰度值。
用MMP14/18S的灰度值比来表示MMP14mRNA的相对表达量。
4.统计学方法:
采用SPSS12.0软件分析,实验数据结果以均数±标准差(
±s)表示。
不同组别间数据比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.形态学观察:
光镜下C组可见肺泡腔完整、间隔均匀一致、肺泡壁光滑偶见PMN;I组可见肺泡壁完整性破坏、肺泡腔有渗出、肺泡间隔增厚、大量PMN浸润;U组仅见部分肺泡壁完整性破坏、少许渗出、少量PMN浸润。
2.大鼠肺干湿重比和BAFL蛋白含量:
肺干湿重比(D/W)在C组明显高于I组和U组(P<0.05);其中U组又明显高于I组(P<0.05);BALF蛋白含量在C组和U组明显低于I组(P<0.05)(表1)。
3.大鼠肺组织匀浆MPO、SOD含量和MMP14mRNA的表达:
MPO活性在I组明显高于C组和U组(P<0.05,表2);
SOD活性在C组明显高于各手术组(P<0.05),其中U组又显著高于I组(P<0.05,表2);
MMP14mRNA的相对表达量以MMP14mRNA与18SmRNA表达量的比值表示,在I组要显著高于C组和U组(P<0.05,表2)。
表1大鼠肺组织干湿重比(D/W)和BAFL蛋白含量(
±s)
Table1LungdrytowetweightratioandBALFPcontent(
±s)
GroupnD/W(100%)BALFpr(mg/ml)
GroupC823.8±1.20.54±0.18
GroupI819.7±0.8*1.03±0.45*
GroupU821.1±1.3*#0.64±0.17#
*P<0.05,comparedwithgroupc;#P<0.05,comparedwithgroupI.
表2大鼠肺组织匀浆MPO、SOD含量以及MMP14mRNA表达量(
±s)
Table2MPO,SODandMMP14mRNAcontentsinlungtissuesofdifferentgroup(
±s)
GroupnMPO(U/gwetfilm)SOD(U/mgprot)MMP14mRNA
GroupC82.38±0.6523.9±1.760.95±0.17
GroupI85.77±1.69*14.1±0.98*1.87±0.31*
GroupU82.49±0.99#20.1±1.53*#1.12±0.25#
*P<0.05,comparedwithgroupc;#P<0.05,comparedwithgroupI.
讨论
肝缺血再灌注后,枯否细胞激活并产生大量氧自由基和促炎症细胞因子如TNF-a[2]。
后者一方面可以直接增加毛细血管通透性[3],另一方面通过激活NF-kB通路促进CXC趋化因子表达进而介导大量中性粒细胞(polymorphonuclearleucocyte,PMN)积聚于肺毛细血管床[4]。
PMN作为主要的炎性细胞通过以下几方面发挥肺损伤作用:
(1)大量PMN淤滞于肺循环造成微循障碍,通过自身激活的β2整合素与内皮细胞表达的内皮细胞黏附分子-1(endothelialcelladhesionmolecule1、ICAM-1)作用后跨内皮移行进入肺间质[5];
(2)释放大量氧自由基氧化细胞膜双层磷脂中的多不饱和脂肪酸,从而破坏肺泡的结构和功能[6];(3)脱颗粒释放大量弹性蛋白酶、MPO和MMP等,分解细胞外基质,损伤内皮血管和肺泡上皮[7],进一步增加毛细血管通透性。
MPO是中性粒细胞的标志酶,特定存在于中性粒细胞溶酶体内,测定肺组织MPO含量可以反映PMN在肺组织内的聚集情况。
而SOD作为一种具有保护作用的酶类能清除超氧阴离子氧自由基从而保护细胞免受损伤。
作为一种在细胞外基质重塑过程中具有重要作用的跨膜金属蛋白酶,MMP14可通过直接降解细胞外基质分子以及间接促进MMP2的表达发挥作用。
正常状态下机体MMP表达量很小,起着维持细胞外基质动态平衡及细胞凋亡的作用,而在病理状态下比如炎症反应中活化的PMN可以释放出大量的MMP,参与破坏细胞外基质,损伤毛细血管内皮和肺泡上皮细胞的基底膜[8]。
近来有研究认为MMP14在大鼠肾缺血再灌注损伤中发挥关键作用[9],而上皮细胞的主要黏附配子—胞外基质大分子层粘连蛋白5(laminin-5、Ln-5)则可能是MMP14发挥降解作用的靶蛋白[10]。
但有关MMP14在肝缺血再灌注肺损伤中作用的研究尚未见报道。
我们的实验结果显示,全肝缺血再灌注组大鼠肺组织HE染色可见肺泡壁完整性破坏、肺泡腔有渗出、肺泡间隔增厚、大量PMN浸润;由于毛细血管通透性增高所以肺干湿重比较对照组大鼠显著降低、BAFL总蛋白含量显著升高;MPO含量升高说明PMN大量聚集于肺组织,有害氧自由基大量生成从而消耗内源性的SOD,所以SOD含量在缺血再灌注组较对照组显著降低;并且在各种炎性刺激之下,肺组织MMP14mRNA表达显著升高。
乌司他丁(UTI)又名尿抑制素,是一种从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的广谱蛋白酶抑制剂,本身是由两个kunitz型区域组成的一种糖蛋白,由143个氨基酸组成,相对分子量约为67kD。
目前认为UTI可通过以下机制发挥保护作用:
(1)作为广谱蛋白酶抑制剂能够抑制PMN释放的弹性蛋白酶、组织蛋白酶,从而减轻它们对组织的损伤;
(2)通过抑制PMN的聚集从而减轻肝脏的缺血再灌注损伤[11];(3)稳定溶酶体膜,减少溶酶体膜破裂释放造成的组织损伤[12];(4)清除氧自由基,并抑制PMN释放的氧自由基[11];(5)抑制PMN、单核巨噬细胞释放TNF-α、IL-6等炎性细胞因子,调节促炎与抗炎因子的平衡[11];(6)抑制LPS诱导代谢产物生成并改善血流动力学状况[13];(7)通过抑制血管内皮细胞ICAM-1的表达[14],从而抑制PMN在血管的黏附和逸出作用,减轻I/R损伤时PMN对血管内皮细胞的损伤。
我们研究的结论显示:
乌司他丁处理组大鼠肺组织HE染色仅见部分肺泡壁完整性破坏、少许渗出、少量PMN浸润,较全肝缺血再灌注组有明显改善;肺干湿重比较I组显著增加而BAFL蛋白含量显著下降说明肺毛细血管通透性有显著改善;MPO含量下降代表乌司他丁预处理后肺组织PMN浸润减少,进而抑制氧自由基的释放,SOD含量显著增加;而肺组织MMP14mRNA表达在乌司他丁处理组也较全肝缺血再灌注组显著降低,说明UTI具有抑制全肝缺血再灌注肺损伤肺组织MMP14mRNA表达的作用。
总之,大鼠全肝缺血再灌注可产生严重的肺损伤,应用乌司他丁可以显著减轻肺损伤的程度,可能的机制包括抑制PMN聚集及抑制肺组织MMP14mRNA的表达。
参考文献
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