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吸收动力学实验中给药方式采用静脉注射和灌胃两种,小鼠静脉给药,,?
后,分布半衰期/分别是.±
.,.±
.,消除半衰期
//分别是.±
.,时间.浓度下曲线面积
./?
.分别.±
.;
小鼠灌胃给药,,
?
后,分布半衰期忍肌分别是..,
.±
.,消除半衰期//分别是.±
.,.
±
.,时间.浓度下曲线面积./?
..分别是.±
.。
抗肿瘤药物吸收动力学符合二室模型,基本
呈药剂依赖关系,消除过程呈非线性动力学,随着浓度的增大呈现饱和消除过程。
抗肿
瘤药物在给药浓度为?
以条件下的绝对生物利用度为.%。
组织分布实
验中小鼠静脉给药?
抗肿瘤药物后,结果显示肾脏浓度最高,肝脏次之,
心,脑,肺药物水平相近。
关键词:
.抑制剂,,,体内药物分析,药代动力学硕士论文
抗肿瘤药物的体内药物分析方法建立和药代动力学研究一....一’,
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抗肿瘤药物的体内药物分析方法建立及药代动力学研究
目录
摘要....。
..。
....。
.........。
........。
......。
............。
....................................................................................................
注释表?
Ⅵ
前言?
.?
.抗肿瘤药物的进展..传统抗肿瘤药物.
..分子靶向抗肿瘤药物?
.抗肿瘤药物的作用机制?
..
.与修复?
...抑制剂与肿瘤治疗?
.体内药物分析?
..体内药物分析中样品的采集与前处理.
..体内药物分析的分析技术?
..体内药物分析方法设计和建立
..体内药物分析的评价方法..体内药物分析的意义?
.药物代谢动力学
.本课题研究意义?
抗肿瘤药物含量测定方法研究.仪器、试药?
..仪器?
..试剂?
.抗肿瘤药物测定方法的建立
..检测波长选择?
..抗肿瘤药物含量的测定方法一
.实验结果?
..抗肿瘤药物的最大吸收波长.
..抗肿瘤药物含量测定结果?
..方法验证
..实验影响因素研究.分析和讨论?
一
目录硕士论文
生物样品中抗肿瘤药物的测定方法?
.仪器、试剂、实验动物及色谱条件
..实验动物
..色谱条件
.实验方法建立.
..血浆样品制备方法..组织样品制备方法?
.实验结果分析..
..生物样品预处理方法分析..分析方法验证?
.分析和讨论?
抗肿瘤药物的药代动力学研究。
.仪器、试剂与实验动物?
.色谱条件?
.实验方法建立。
..抗肿瘤药物在小鼠体内吸收动力学实验?
..抗肿瘤药物在小鼠体内组织分布动力学实验?
..实验结果
结论与展望.
.结论?
.展望?
翌筻谢..?
.................。
.....。
.........?
...。
参考文献?
’。
’?
’●。
●。
●●。
’
硕士论文抗肿瘤药物的体内药物分析方法建立及药代动力学研究
注释表
前言
随着物质生活水平的不断提高,环境中对人体有害的因素也在不断增长,而由此带
来的疾病也越来越多,其中恶性肿瘤已经成为当今世界威胁人类生命健康的三大疾病之
一。
我国常见的影响人类生命健康的恶性肿瘤有:
肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、
白血病、恶性淋巴瘤等。
目前恶性肿瘤的治疗通常会采用手术、放疗和化疗相结合的一些治疗措施,其中化
疗是一种全身性治疗方法,不仅可以消除目标肿瘤,还可以将远距离转移的癌细胞杀死,
所以在综合治疗中占有很重要的地位【】。
而在临床上被大量使用的化疗药物大多数都是
细胞毒性类药物,但是细胞毒性类存在毒性大、无选择性、实体瘤的减小作用小等缺点
【捌。
因此,为了实现抗肿瘤药物的有效安全性,我们需要寻找新的作用靶点。
近年来,
国内外研究机构对抗肿瘤药物的研究主要集中在针对作用机制的非细胞毒性抗肿瘤药
物,传统的细胞毒性抗肿瘤药物已逐步被淘汰。
目前已经研发了许多的新型抗肿瘤药物,
取得了大量创新性的突破。
.抗肿瘤药物的进展
..传统抗肿瘤药物
传统抗肿瘤药物根据其来源和化学结构的不同可分为:
抗代谢类,烷化剂类,抗生
素类,抗激素类和激素类以及杂类;
按照生化机制不同可分为:
干扰核酸生物合成的药
物,干扰转录过程的药物,干扰激素平衡的药物,影响结构及其功能的药物,阻
碍合成的药物,影响蛋白质合成及其功能的药物等。
在长期的化疗实践中发现,传统抗肿瘤药物的选择性不强,对正常细胞的杀伤力也
很强,尤其如骨髓、头发等增殖较快的细胞,药物在抑制癌细胞的同时会带来许多了副
作用【】
..分子靶向抗肿瘤药物
当前抗肿瘤药物的研究重点在三方面:
新的作用靶点、新的抗癌活性物质、新的实
验方法,其中又以研究新的作用靶点为主】。
随着医药技术的发展,药物研究进入分子
生物的时代,出现了一大批新型的分子靶向抗肿瘤药物,其原理是根据肿瘤细胞和正常
细胞之间分子生物学上的差异,将药物作用于肿瘤发生和转移的不同环节和新靶点,其
中靶点包括酶、受体、蛋白以及基因,最终将导致肿瘤细胞的凋掣。
分子靶向药物的
作用途径主要有改变血管生成和细胞增殖信号的转导途径,及阻遏基因丢失功能的转导
等。
分子靶向药物治疗有望成为比传统的药物化疗更为高效、药物副作用更小的肿瘤治前言
疗方法【捌。
.抗肿瘤药物的作用机制
抗肿瘤药物是苏州汉德森公司自主研发的酞嗪类抗肿瘤药物。
也是目前研究热门.抑制剂,是属于分子靶向治疗中一种。
经体内外研究
和药效学验证,抗肿瘤药物具有较强的抗肿瘤作用,对抑制乳腺癌和卵巢癌有
明显的效果。
其作用机制主要是通过抑制肿瘤中?
的活性,从而抑制肿瘤细胞中
的修复,已达到杀死肿瘤的目的。
抗肿瘤药物的主体结构见图.为保
密结构。
图.抗肿瘤药物主体结构图
...与修复
聚核糖聚合酶
是一类蛋白修饰酶,存在于
多数真核细胞中,其主要是存在于细胞核内,也有少部分存在于细胞浆内【】。
的
主要功能是调节细胞的表达,包括保持染色体的结构完整以及参与复制和转录,
从而维持细胞内环境和基因组的稳定。
当受到损伤断裂时,就会被激活对
受损的序列进行修复。
在损伤中起到了分子感受器的作用,它可以识
别断裂处,激活受体蛋白的聚核糖基化,从而参与的修复【。
.是家族中含量最为丰富的一种,也是家族中最先被发现,并且
特性了解最清楚的成员,具体结构见图.。
研究发现,.在修复和细胞凋亡
过程中发挥着举足轻重的作用,.是通过催化核糖化,促进染色质松解并募
集线修复交叉互补基因,从而达到修复受损的目的。
.识别缺口后活
化形成为同型二聚体,同时催化尼克酰二核苷酸降解为烟酸和,然后以
为底物包括其本身合成为聚腺苷酸二磷酸核糖基,从而改变其功能【,具体
途径见图.。
其中受体蛋白包括.自身、组蛋白、依赖型蛋白激酶,各种转
录因子、修复子以及信号转导子包括.,.,.,,.等,此后,
.从上释放出来,被聚..核糖水解酶水解,修复酶结合到
的断裂处,起到修复的功能【现】。
自身修复域腻瑚缸
结合域:
曲啦豫洫
结合域峨岫
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、
▲,
鼢静
动¨
潮饼
铷堍艟蒯
图..结构图
活
雕哌附
嗍●
琵燃
图..代谢过程
.抑制剂与肿瘤治疗
从分子水平而言,治疗恶性肿瘤基本上都是通过损伤肿瘤细胞中的来杀死肿瘤
细胞,例如放疗和化疗等,但在杀死肿瘤细胞同时也杀死了大量的正常细胞。
所以,近
年来大家开始参与到以损伤识别和修复为研究中心的分子靶向治疗中来。
据研究显
示.在修复、基因组的稳定、细胞死亡、增殖分化等方面都发挥着非常关键
的作用,大量数据推测通过抑制√时.的活性可抑制一系列由氇一介导的修复
机制,使肿瘤细胞在放疗和化疗过程中更易受损,这一发现对肿瘤的治疗存在巨大
的潜在价值。
大量研究发现,恶性肿瘤细胞中的.活性增强,通过剔除.基因或者使
用.抑制剂可以降低肿瘤细胞的修复功能,增强癌细胞对损害因子的
敏感度,从而达到提高化疗和放疗的效果【。
目前,.抑制剂已进入到抗肿瘤药物期临床实验研究阶段,研究表明.
抑制剂在联合化疗,单独化疗以及放疗方法都取得了成功。
.抑制剂的单独使用在
乳腺癌中取得了显著的进展,其中就有已经成功上市的为抗肿瘤药物研发指明
了新方向,.将成为治疗肿瘤的一个新靶点。
.体内药物分析
体内药物分析是为了适应药代动力学、生物药剂学和
临床药理学等学科而迅速发展起来的。
体内药物分析主要是通过测定人或者动物的体
液,以及组织器官中药物及代谢物浓度,从而获悉药物在体内的转变方式、代谢途径以
及药代谢动力学的各种参数。
体内药物分析数据可以用来改进药物的研发合成和临床研
究方案等。
体内药物分析的主要特点是生物样品成分复杂,干扰物质多,被测组分含量较低,
因此,体内药物分析的发展与生物样品的预处理技术、分离技术以及检测技术息息相关,
随着这些技术的发展体内药物分析也得到了不断提升【。
..体内药物分析中样品的采集与前处理
药物进入生物体内后处于一个非常复杂的生物介质中,并且药物在生物体内的浓度
是呈微量、动态变化。
药物在体内经过吸收、分布、代谢等一系列过程后其化学结构和
物理状态都发生改变,其中化学结构的改变主要是由于药物在体内各种代谢酶的作用下
会产生一个或多个代谢产物,物理状态的改变主要是药物及其代谢物会与血浆蛋白结合
脚。
由于这些变化使得体内药物分析不但需要考虑到药物以及代谢物本身的结构和性
质,而且还应考虑其在生物体内的存在状态。
因此,生物样品在分析之前必须经过适当
的采集和处理。
...样品的采集
目前样品采集分为两种,一种是体液的采集,另一种是组织器官的采集。
体液样品
的采集以血液和尿液为主,除此之外还有唾液、乳汁等其他部位的体液,收集血浆样品
多采用心脏采血,眼眶采血等方法。
组织器官的采集对象多为小鼠,通常采用在给药一
定时间后迅速处死小鼠,取下小鼠的各个组织或者器官,制备成组织匀浆液的方法【。
...样品的预处理
样品的预处理主要有三方面的问题:
生物样品的种类、待测药物的性质以及测定的
方法。
生物样品的分离、纯化技术主要是根据其类型的不同来区分。
比如,血浆或血清
样品需要蛋白沉淀处理,使得药物能从蛋白结合物中释放出来;
尿液样品则需要酶或酸
水解,使药物能从缀合物中释放出来;
唾液样品中的黏蛋白则采用离心沉淀方法去除。
药物在生物样品内的浓度往往很低,为了检测到药物或其代谢物,并使其在方法要
求的检测范围内,必须进行预处理。
样品预处理主要包括了分离、纯化、浓缩三个步骤。
目前主要有液一液提取法、液一固提取法、固相萃取、固相微萃取等方法。
液一液提取法
绝大多数药物都是亲脂性的,其在有机溶剂中的溶解度高于在水相中的,而生物样
品中所含的内源性杂质大多都是亲水性的。
利用药物的这一特性,可以采用有机溶剂提
取药物,去除生物样品中绝大部分的杂质,然后将提取后的待测药物进行浓集,最后进
行检测分析。
固相萃取技术
由于其仪器简单,选择性高,溶剂消耗量少,可
固相萃取.
现场预处理,易自动化等优点被广泛应用于各种生物样品的分离和纯化。
其原理是:
将
不同的填料作为固定相填入小柱中,药物或杂质受到吸附、分配和离子交换的作用,被
保留在柱体上,再用合适的溶剂将杂质洗去,最后用合适的溶剂将药物洗脱下来邺¨
刘一钊等【】在采用固相萃取小柱处理样品对索他洛尔进行血药浓度测定,
结果显示采用了固相萃取小柱后沉淀杂质明显减少,最低检测限达到./浓度为
高、中、低的样品的萃取回收率分别是.%、.%、.%,满足血药浓度监测
的要求。
向大雄【等人对犬血浆中葛根素含量研究时,由于葛根素口服吸收差,其体内血药
浓度低,作者采用固相萃取方法,用萃取小柱对生物样品进行前处理,结果
显示该方法简单易行且回收率高,样品中的葛根素得到了很大程度的富集,提高了检测
的灵敏度。
固相萃取板分析人血浆中可的松和氢化可的松,
】等人采厍
将止血浆样品用甲醇洗脱,然后洗脱液进入高效液相色谱一质谱.进行分
析,最低检测限可达./,线性范围为../,达到了很好的检测效果。
李楚云【】等人采用固相萃取.快速测定全血环孢素的浓度,全血经乙腈沉淀
后用萃取柱萃取,%甲醇洗脱杂质,%甲醇洗脱药物,洗脱液进入检测,
结果显示方法提取回收率.%,在.肛/范围内有良好线性关系。
固相微萃取技术
固相微萃取技术是在基础上建立起来的,由加拿大大学
研究小组在世纪年代末首次提出。
其特点是集进样、萃取、浓缩功能于一
体。
克服了操作繁琐,吸附剂孔道容易堵塞等缺点,而且还有无需溶剂,
样品需求量少,萃取速度快,操作简便和直接处理复杂样品等优点。
】等人用硕士论文
和.联用对尿液中的草药中氯苯酚进行检测分析,结果显示:
尿液浓度为./
时就能够检测到氯苯酚类物质,当浓度在.肛/范围内时,低于%,并且
方法重现性好。
目前已有装置投入商品化生产,并且有许多的研究成果用于体内
药物分析【。
柱切换技术
随着在体内药物分析中的广泛使用,生物样品分析中样品的预处理显得极为
重要。
但预处理通常存在样品需要量大,试剂使用量大,处理时间长,误差较大等缺点
引,柱切换技术的发展极大地解决了这一问题。
柱切换技术最显著的特点是在第一根柱
子里完成检测物质与杂质问的分离,在第二根柱子里完成检测。
这种方法达到了在线分
离检测的目的,不仅使得微量样品在富集过程中不受到污染,还能在同一体系内以多种
切换方式来分离复杂的组分【”】。
张群艳【等人采用了柱切换.技术测定血浆中卡托普利浓度:
在衍生化反应后
含卡托普利的血浆中加入等体积的丙酮和水,振荡离心提取上清液,最后采用.柱
切换进行分离测定,结果显示其在~/范围内有良好的线性关系,方法回收
率为%,为后续的药动学研究和临床学研究提供了良好的方法。
叶利民等【】采用
预
.柱切换技术来测定犬血浆样品中茶碱血药浓度,预处理柱为
处理流动相为水;
分析柱是.
色谱柱流动相是甲醇:
水:
结
果显示血浆茶碱最低检测浓度为./,线性范围为~/,平均净化回收率为
%。
等人用柱切换技术检测了尿中的雷莫拉宁浓度,结果显示
定量限为./,检测限为../,在.~./浓度范围内有良好的线性关系,
用了柱切换技术后,整个分析时间只需,与之前用微生物法测定相比大大提高了
检测的准确度和灵敏度。
等人建立了自动柱切换技术直接分离测定血浆中甲氨蝶
呤及其代谢物的方法,结果显示相对回收率大于%,最低检测限为.和./。
向
瑾【等人采用柱切换贝定人血浆中布洛芬对映体浓度,柱切换条件采用流动相正
己烷:
异丙醇.:
流速为./,柱切换时间为.~.;
采用流动
相正己烷:
异丙醇:
三氟醋酸.:
.:
.,结果显示:
方法回收率为.%.%,
日间和日内都小于%,方法操作简单,准确率高。
..体内药物分析的分析技术
体内药物分析是测定复杂生物样品中药物以及其代谢产物的方法,由于样品中药物
的含量很低,因此采用选择性强、灵敏度高的分析方法非常重要,所以分析技术是体内
药物分析中最关键技术之一【。
生物样品经过预处理后都需要进行分离和检测,而色谱法因为其高灵敏度和高选择
性被视为体内药物及其代谢物强有力的分析技术,并被广泛使用着。
目前采用的色谱分
析方法主要有有高效液相色谱,超高效液相色谱。
引,亲水型色谱
‘】等。
此外,色谱与核磁共振、质谱的联用也备受关注。
...高效液相色谱法
是世纪年代
高效液相色谱法
末迅速发展的一种新型分离技术。
是在经典液相色谱的基础上,采用微粒型填料
作固定相,再配以高压送液泵及高灵敏度检测器。
高效液相色谱法因为具备准确性好、
灵敏度高、专一性强等特点,成为体内药物分析中重要分析手段之一【¨
而建立良好的
高效液相色谱分析方法对后续的体内药物分析及药代动力学研究也具有重大的意义。
目前体内药物分析中使用较多的还是.,据美国药典显示有%的分析方
法都是采用.。
我国新药典也逐步淘汰简单的化学和物理分析方法,而采用
来测定药品含量。
以下介绍一些.在体内药物分析中的实例:
宋沁馨、丁黎【】等人采用心.玎测定巴洛沙星的人体血浆浓度,该方法的色谱柱
.,柱,流动相为水.乙腈.胺.冰醋:
为
巴洛沙星的紫外检测波长,二氯甲烷为提取剂;
实验结果显示巴洛沙星在..一
/范围内线性关系较好.,提取回收率为.%.%,相对回收率
为.~.%。
刘广兴【】等人用?
建立了阿仑膦酸钠体内分析方法:
采用
色谱柱×
.,,甲醇.缓冲液含/柠檬酸和/焦磷
酸钠.乙腈.水为流动相,梯度洗脱,荧光检测器检测;
该方法线性范围为~/,
线性关系良好.;
方法回收率、日内和日间精密度的均小于%;
该方法切
实可行,且重现性较好,可用于阿仑膦酸钠药代动力学研究。
肖寒露【】等人建立能同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁浓度的分析方
法:
大鼠血浆样品以石杉碱甲为内标,液液萃取法处理后用.柱分离,以乙
腈,./庚烷磺酸钠和./磷酸二氢钾等量混合后用%磷酸调.:
作为流动相,检测波长,结果显示马钱子碱和士的宁在~扯/范围内线性
关系良好,平均提取回收率均大于%,日内、日间精密度均小于%,稳定性符合体内
药物分析要求。
金鸣【】等人建立定血浆及尿液中异烟肼方法,用衍生化试剂香草醛将异
烟肼经柱前衍生为异烟肼香草醛腙,然后直接对样品进行定性、定量分析,结果显示,
该方法在浓度./一./范围有良好的线性关系,检测限为./;
日内、日
间精度均小于.%,回收率大于.%,满足了异烟肼在临床药物分析的需要。
汪震、刘东【】等人建澳定血浆加巴喷丁浓度的方法,以替米沙坦为内标,
沉淀蛋白剂是乙腈,衍生化剂是邻苯二甲醛,色谱柱为柱,流动相为乙腈
../磷酸二氢钾溶液:
为.,流速./;
结果显示:
线性范围为
前言硕士论文
../.,低、中、高三种浓度的平均回收率分别为.%,.%,
.%,最低检测限为./。
苏启表岭等人用法测定大鼠血浆中抗肿瘤化合物.浓度,流动相为甲
醇.
.磷酸氢二钾缓冲液..三乙胺:
.,萃取剂是乙醚,检测波长
;
结果显示为~“/范围有良好的线性关系,日为于.%,日间
小于.%;
提取回收率在.%.%范围,相对回收率在.%~.%范围,
最低检测限为/。
...超高效液相色谱
作为近年来发展起来的分离技术,其采用的是.颗粒度的色谱柱填料,而
柱长则比普通色谱柱缩短了一半,工作压力达到了。
与相比较,其
最大的特点是能够获得更高的柱效,有助于在实验过程中提高流动相的流速,改善色谱
的分离度、灵敏度,这使得液相色谱的分离能力得到延伸和扩展,同时极大地提高了分
析工作的效率和质量【引。
居文政【】等人建./同时测定静脉滴注注射银黄后
人体内黄芩苷和绿原酸血药浓度的方法,山柰素为内标,流动相为甲醇.%甲酸.
水.%甲酸梯度洗脱,黄芩苷的线性范围为.×
/,绿原酸的线性
范围为.
/,两者的日内、日间精密度都小于.%。
删建立
./测定鼠血浆中种化合物的方法,种化合物的最低检测限在..‖,
线性关系..;
实验还与./方法相比较,结果显示:
在其他情况
一致的情况下,的分离时间为的四分之一,测定组分的检测峰高是其倍,
而峰宽是其一半。
...亲水型色谱
与反相色谱相比,亲水型色谱可以有效地保留那些在反相色谱中保留弱或者不能保
留的强极性碱性药物。
亲水型色谱固定相采用极性化合物,流动相采用有机相很高的缓
冲溶液,这弥补了大多数反相色谱中流动相的有机相含量较低的不足。
在采用.电
喷雾电离质谱法检测时,由于反相色谱中流动相的纯水比例会比较高,使得后续的离
子化效力降低,而亲水型色谱的流动相中有机溶剂比例较高,这样离子化效率就会得
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