分子试验设计Word格式文档下载.docx
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50mmol/L葡萄糖、10mmol/EDTA-Na、25mmol/LTris-HCl(pH8.0)分散细胞,其中螯合金属离子使酶失活,防止DNA的降解;
0.4mol/LNaOH和2%SDS临用前1:
1配制,使细胞裂解,蛋白质与染色体DNA发生变性;
60ml5mol/L醋酸钾、
11.5ml冰醋酸、28.5ml双蒸水使DNA在酸性条件下复性,留在上清液,大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
1.1.4实验用品:
1.1.4.1仪器:
恒温摇床,高压灭菌锅,超净工作台,10、100、1000μL微量移液器各一支,台式高速离心机,制冰机,混合漩涡器。
1.1.4.2材料:
含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液、.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、试剂瓶)等
1.1.4.3试剂:
LB培养液:
胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl5g,琼脂(固体培养基)15g,用1NNaOH调pH7.5。
溶液Ⅰ:
50mmol/L葡萄糖,10mmol/EDTA-Na,25mmol/LTris-HCl(pH8.0);
溶液Ⅱ:
0.4mol/LNaOH,2%SDS,临用前1:
1配制;
溶液Ⅲ:
5mol/L醋酸钾60ml,冰醋酸11.5ml,双蒸水28.5ml;
卡纳霉素(50mg/mL);
抽提液(饱和酚:
氯仿:
异戊醇=25:
24:
1);
无水乙醇;
70%乙醇;
TE缓冲液或ddH2O
1.1.5步骤:
1.1.5.1将含pET-28a质粒的大肠杆菌,含pEGFP-N3质粒的大肠杆菌分别接种在液体培养基中(加卡那霉素50μg/mL),37℃培养过夜。
1.1.5.2取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中,10000rpm离心2min,弃上清液。
1.1.5.3加入100μL溶液I,漩涡器上充分混匀,在室温下放置10min。
1.1.5.4加入200μL新配制的溶液Ⅱ,轻轻翻转2~3次,使之混匀,冰上放置5min。
1.1.5.5加入150μL冰冷的溶液Ⅲ,盖紧后,温和颠倒3-5次使混匀,产生白色絮状物,冰上放置15min。
1.1.5.610000rpm离心5min,取上清液于另一干净的离心管中。
1.1.5.7向上清液中加入等体积(约400μL)酚:
氯仿/异戊醇(25:
24:
1,v/v),振荡混匀,10000rpm离心10min,将上清液转移至新的离心管中。
1.1.5.8加入等体积(约370μL)氯仿/异戊醇(24:
1),混匀,离心2min,取上清液于新离心管中。
1.1.5.9向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀,-20℃放置1h。
1.1.5.1012000rpm离心5min,倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
1.1.5.11加800μL70%乙醇,12000rpm离心1min,倒尽上清液,室温自然干燥30min。
1.1.5.12加30μLddH2O,-20℃保存备用。
1.1.6注意事项:
)
1.1.6.1饱和酚(取下层)单独吸200μL,氯仿:
异戊醇(24:
1)吸200μL。
1.1.6.2制备质粒过程中,所有操作必须缓和,不要剧烈振荡(特别是加入溶液II和III),以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。
1.1.6.3在取各种试剂的过程中,一定注意移液器吸头的更换,避免污染。
1.2琼脂糖电泳检测
1.2.1方法:
琼脂糖电泳
1.2.2原理:
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率(U)的对数与凝胶浓度(T)之间存在反平行线性关系。
因此,要有效地分离不同大小的DNA片段,选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
在质粒提取的过程中,由于操作原因,提取的质粒可能有三种:
线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度:
闭环超螺旋〉线状〉开环。
但有时也有也会出现相反情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。
1.2.3实验用品:
1.2.3.1材料和仪器
电泳仪,电泳槽,样品槽模板(梳子),有机玻璃内槽,微波炉,水平仪,10、100、1000μL微量取液器各一支,凝胶成像系统,提取的pET-28a和pEGFP-N3质粒,琼脂糖,锥形瓶,一次性手套,胶铲,封口膜,剪刀,取液器吸头。
1.2.3.2试剂
Goldview(DNA染料);
0.5×
TBE缓冲液:
Tris10.88g、硼酸5.52g、EDTA·
Na2·
2H2O0.74g,定容至200ml,使用时稀释10倍;
6×
上样缓冲液:
溴酚蓝0.25%、蔗糖40%;
DNAmarker。
1.2.4步骤:
1.2.4.1琼脂糖凝胶板的制备
称取0.3g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入30mL0.5×
TBE缓冲液,微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却到65℃(不烫手为宜),加入1μLGoldview混匀,排除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽(插入样品槽模板梳子)内。
静置30min左右,轻轻晃动拔出梳子。
1.2.4.2加样
胶板放入电泳槽中(样品孔位于负极),注入0.5×
TBE缓冲液淹没过胶板5mm,用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL6×
上样缓冲液混匀,加入胶板的样品小槽内。
1.2.4.3电泳
将电泳槽与电泳仪接通,调节电压为100V左右,直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处,停止电泳。
1.2.4.4观察和拍照
将胶板小心取出,放入凝胶成像系统中,调节位置居中,波长为254nm的紫外灯下,观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
1.2.5实验结果预测:
正常情况下会出现两条条带(闭环和开环质粒)。
2、基因表达载体的构建
1、DNA限制性内切酶酶切
1.1方法:
DNA限制性酶切
1.2原理:
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)。
酶切位点:
BamHI
NotI
1.3实验用品:
1.3.1材料:
实验一提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a,0.2mlEP管,取液器吸头,一次性手套
1.3.2试剂:
NotI,BamHI,ddH2O,10×
buffer,琼脂糖,Goldview
1.3.3设备:
移液器,台式高速离心机,凝胶电泳系统,凝胶成像系统,恒温培养箱
1.4步骤:
1.4.1分别去两支0.2mlEP管做上记号:
如①②
1.4.2两个EP管中分别配置下列的30μL体系:
①号管
②号管
BSA
3μl
10xBuffer
NotI
2μl
BamHI
质粒
pET-28a:
20μl
pEGFP-T1:
1.4.3将两只EP管混匀后瞬时离心,放入恒温培养箱370C酶切3h。
1.4.4取5μL①②EP管的酶切反应液,同时取5μL原质粒溶液作对照,进行电泳检测酶切结果。
1.4.5按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段
2、连接重组
2.1方法:
DNA连接重组
2.2原理:
连接的DNA分子具备的条件:
具有相同粘性末端(同种酶切的片段)的DNA分子比较容易连接在一起,因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。
连接反应温度:
理论上讲,连接反应的最佳温度是370C,此时连接酶的活性最高。
但370C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定,因此,人们找到了一个最适温度,即12~160C。
此时既可最大限度地发挥连接酶的活性,又有助于短暂配对结构的稳定。
本实验选择160C。
2.3实验用品:
2.3.1材料:
酶切后的EGFP和pET-28a,0.2mlEP管,取液器吸头,一次性手套
2.3.2试剂:
T4DNA连接酶,ddH2O,T4DNA连接酶buffer
2.3.3设备:
移液器,台式高速离心机,PCR仪
2.4步骤:
2.4.1在EP管中分别配置下列的体系:
0.2mlEP管
10xbuffer
酶切后的pET-28a
Xμl
没切后的EGFP片段
Yμl
T4DNA连接酶
X:
Y=1:
3~10,用水补足20μL。
2.4.EP管中液体混匀后瞬时离心,放入培养箱160C反应过夜后,-200C下保存用于转化。
3.重组DNA的转化及重组子的鉴定
3.1重组DNA分子的转化
3.1.2方法:
热转化法
3.1.3原理:
细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于00C,在有CaCl2存在的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经420C短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(在本实验中为卡那霉素抗性)得到表达。
在含Kana的选择性培养基上进行重组子的鉴定
E.coliEH5α是一种常用于质粒克隆的菌株,可以使质粒高拷贝数扩增,获得大量的质粒
3.1.4实验用品
3.4.1材料:
重组质粒pET-28a-EGFP,E.coliDHα5
3.4.2用品:
摇床,玻璃涂布器
3.1.5步骤
3.1.5.1取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻,每200μL解冻的感受态细胞加入整管连接产物,混匀后冰浴30min
3.1.5.2420C热冲击60秒,立即置于冰浴5min。
3.1.5.3再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基,于370C摇床中培养1h。
3.1.5.41h后,6000r/min离心3min,去掉上清(约留200μL的培养液),摇匀菌块。
3.1.5.5用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上,正置培养皿半小时后,370C培养箱中倒置培养皿过夜。
3.1.5.6第二天早上观察结果。
3.1.6结果预测
由于转入的pET-28a质粒含有卡那霉素的抗性基因,所以能够在含有Kana的培养基上面生长
3.1.6.1培养基上长出正常的菌落,表示质粒转入成功
3.1.6.2培养基上形成小菌落,转入的质粒只一直沿着单个细胞遗传下去
3.1.6.3未长出菌落则说明转入失败
3.2重组子的鉴定
由于质粒pET-28a和质粒pEGFP-N3相同的酶切位点为BamHⅠ和NotⅠ,两个酶切位点之间并无标记基因,所以即使在选择培养基上表达为阳性,也可能说明转入的为pET-28a质粒,并不能完全确定为重组质粒,所以需进行重组子的检测
3.2.1PCR原理:
利用PCR和双酶切的方法对重组子进行鉴定
PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应,主要有变性—退火—延伸三个步骤组成:
高温变性-94℃下DNA双链解旋为单链;
低温退火-55℃左右时,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合
温延伸-72℃时,Taq酶以4种dNTP为原料,
引物为复制起点,按5′→3′方向,
复制模板的互补链。
按此循环(变性—复性—延伸),一般重25~30次,短时间内,使目的基因片段扩增2n(n代表循环次数)。
3.2.1.1实验材料
3.2.1.2材料
DNA模板,4×
dNTP,T7正反引物,Taq酶,琼脂糖,MarkerDNA,吸头
3.2.1.3试剂
10×
buffer,15mmol/LMgCl2
3.2.1.4仪器
PCR热循环仪,琼脂糖凝胶电泳系统
3.2.2双酶切原理:
由于质粒的黏性末端是NotI,BamHI,两种限制性内切酶切割产生的,载体和目的基因的粘性末端互补配对形成重组质粒,所以在重组质粒上也存在NotI,BamHI的酶切位点,在阳性克隆的细菌中提取质粒,双酶切过后对酶切后的产物检验,可以验证是重组质粒是否转化成功。
3.2.2.1实验材料
3.2.2.1.1试剂NotI,BamHI,10×
buffer,
3.2.2.1.1设备移液器,台式高速离心机,凝胶电泳系统,凝胶成像系统
3.2.2.2步骤
3.2.2.2.1取一只0.2ml的EP管
3.2.2.2.2EP管中配置下列的体系
EP管
BSA
3μL
10×
buffer
NotⅠ
2μL
BamHⅠ
重组质粒
20μL
3.2.2.2.3将EP管混匀后瞬时离心,放入恒温培养箱370C酶切3h。
3.2.2.2.4取5μLEP管的酶切反应液,同时取5μL目的基因溶液作对照,进行电泳检测酶切结果。
3.2.2.2.3结果预测
3.2.2.2.3.1酶切产物中只出现一条带,证明重组质粒转入成功
3.2.2.2.3.2酶切产物没有出现条带,证明转化失败
3.3减小误差方案由于是直接从平板中挑去菌落,转化后的细菌细胞壁外会附着一些阳性克隆。
所以可能会导致PCR结果成阳性,在实验当中应该避免这一点,方法可以有挑取单克隆菌落后在10ul的双蒸水或没有核酸酶的水中吹打几下,再取2ul作模版
3.4对根据电泳的结果对阳性质粒导入车成功的菌落进行扩增培养,使重组质粒得到大量的拷贝。
4.重组子的表达
4.1原理:
BL21(DE3)菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
4.2实验材料
4.2.1材料
E.coliBL21,重组质粒
4.2.2设备:
LB培养基,荧光显微镜
4.3步骤
步骤
4.3.1.取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻,每200μL解冻的感受态细胞加入5μLpET-28a-EGFP质粒,混匀后冰浴30min
4.3.2.420C热冲击90秒,立即置于冰浴5min。
4.3.3.再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基,于370C摇床中培养1h。
期间将200μL的24mg/mlIPTG涂布在含Kana的LB培养基上,待用。
4.3.5.1h后,6000r/min离心5min,去掉上清(约留200μL的培养液),摇匀菌块。
4.3.6用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上,正置培养皿半小时后,370C培养箱中倒置培养皿过夜。
4.3.7第二天早上观察结果。
4.4实验结果
若观察到绿色荧光表明实验成功,若无绿色荧光则说明实验失败
参考文献
【1】Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞实验研究程刚吴兆翔杨华刚马志簪
【2】高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展
【3】抗菌肽CM4基因克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定
【4】嗜热子囊菌光孢变种cbhl基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达
【5】细菌质粒与基因工程
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- 分子 试验 设计