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denaturinggradientgelelectrophoresis
目录
摘要I
ABSTRACTII
1.绪论1
1.1水环境恢复与污水再生全流程的提出1
1.1.1我国水环境现状1
1.1.2污水脱氮除磷难题1
1.1.3污水再生全流程的提出2
1.1.4生物除磷机理3
1.1.5除磷工艺的选择4
1.2A/O除磷研究现状5
1.2.1提高磷去除率的研究5
1.2.2除磷微生物特征的研究6
1.2.3污泥膨胀等异常现象的研究6
1.3全流程赋予A/O的新特点7
2.材料与方法8
2.1实验装置8
2.2运行参数9
2.3原水水质9
2.4分析方法与仪器9
3.全流程A/O除磷准佳运行参数的研究12
3.1出水水质要求12
3.2影响A/O除磷效果的运行参数12
3.3DO与NSCOD的优化13
3.3.1DO与NSCOD对A/O除磷效果的调控13
3.3.2系统沿程DO的优化14
3.4pH变化与生物除磷的关系15
3.5进水碱度对生物除磷的影响15
3.6本章小结16
4.A/O除磷系统中氮素转化研究18
4.1A/O深度除磷中氮的形态与转化18
4.2A/O系统低氮素转化研究19
4.2.1进出水氮素变化19
4.2.2影响氨氮转化的因素研究19
4.2.3A/O系统中氮素损失析因22
4.2.4氨氧化细菌、亚硝化细菌淘汰机制研究22
4.3本章小结23
5.A/O除磷系统中COD的同时去除24
5.1出水水质要求24
5.2除磷对COD去除的影响24
5.3氮素转化对COD去除的影响26
5.4本章小结27
6.A/O除磷系统中群落结构分析28
6.1DGGE技术简介28
6.2A/O系统微生物群落结构分析29
6.2.2样品总DNA的提取与纯化29
6.2.3目的基因的PCR扩增30
6.2.4总细菌16SrDNAV3片段的DGGE分析32
6.2.5QuantityOne软件的DGGE图谱分析33
6.2.6DGGE条带的测序和同源性分析35
6.3本章小结35
结论37
致谢38
参考文献39
1.绪论
1.1水环境恢复与污水再生全流程的提出
1.1.1我国水环境现状
据2010年中国环境状况公报[1]报道,26个国控重点湖泊(水库)中,满足Ⅱ类水质的1个,占3.8%;
Ⅲ类的5个,占19.2%;
Ⅳ类的4个,占15.4%;
Ⅴ类的6个,占23.1%;
劣Ⅴ类的10个,占38.5%。
主要污染指标是总氮和总磷。
大型水库水质好于大型淡水湖泊和城市内湖。
26个国控重点湖泊(水库)中,营养状态为重度富营养的1个,占3.8%;
中度富营养的2个,占7.7%;
轻度富营养的11个,占42.3%;
其他均为中营养,占46.2%。
全国600多个城市中有2/3供水不足,其中1/6的城市严重缺水,且随着社会经济的发展,对水的需求将不断增长,缺水势态也将随之更加突出[2]。
据资料[3]报道,2008年全国废水排放量为1347亿t,在现有废水处理水平正常提高的情景下,到2020年将达到1697亿t,增长约26%,废水排放总量呈上升趋势,水污染的威胁正在不断增加。
而我国现有的污水处理厂主要集中于有机物的去除,对氮、磷等营养物的去除率只达到10%~20%,其结果远达不到国家二级排放标准,造成大量氮磷污染物进入水体,引起水体的富营养化。
随着我国经济的高速发展,水资源短缺的状况正在逐步加剧,水污染还没有得到有效遏制,整体水环境质量还在不断下滑。
1.1.2污水脱氮除磷难题
自20世纪初,以活性污泥法为代表的污水生化处理技术建立以来,都是以去除含碳有机物为核心的污水二级生化处理。
其处理水的水质水平仅能达到BOD520mg/L、SS20mg/L,而原污水中氨氮和磷只有部分用于细胞合成,出水中只少有去除。
近年,我国明确提出污水处理厂逐步要达到.GB18918-2002城镇污水处理厂综合排放新标准[4]一级A的要求,该标准对氮、磷都做了严格的规定,其中TN≤15mg/L,TP≤0.5mg/L,绝大多数污水处理厂都未能达到要求。
传统的脱氮除磷工艺,将氮、磷在同一反应器中去除,聚磷菌和硝化菌、反硝化菌等多种微生物共同生长在一个系统内,不同功能的微生物均不能在各自最佳的生长条件下生长,进而存在下列问题[5]。
1.1.2.1碳源的争夺厌氧环境下反硝化与释磷过程对碳源存在着竞争。
根据生物除磷原理,在厌氧条件下,聚磷菌通过菌种间的协作,将有机物转化为挥发酸,借助水解聚磷释放的能量将之吸收到体内,并以聚β羟基丁酸PHB形式贮存,提供后续好氧条件下过量摄磷和自身增殖所需的碳源和能量。
如果厌氧区存在较多的硝酸盐,反硝化细菌会以硝酸盐为电子受体,有机物为电子供体进行反硝化,消耗进水中有机碳源,反硝化反应基本结束时磷的释放过程才开始进行。
由于反硝化菌与聚磷菌争夺碳源而使释磷时间大大滞后;
溶解性有机物浓度的降低又使释磷反应进入非线性阶段,释磷速度大大下降,而释磷量的减少会导致好氧阶段磷的吸收能力下降,磷的去除率降低。
1.1.2.2泥龄的矛盾硝化菌基本上属于自养型专性好氧细菌,由于其代谢产能低,其突出的特点是生长速率慢、世代期长,在系统内要保持较高浓度的硝化菌,就要求在较长的泥龄下运行。
系统除磷的主体聚磷菌多为短世代微生物,可以在较短的泥龄下正常生长,因此在较短的泥龄下运行时可获得较高的除磷效率。
显然,在运行泥龄上,传统工艺在脱氮与除磷之间存在着矛盾。
1.1.2.3工艺本身的矛盾——脱氮靠硝化液回流传统工艺脱氮一般采用前置反硝化手段,依靠回流硝化液实现脱氮。
回流硝化液向厌氧段注入了大量硝酸盐,加剧了厌氧段反硝化细菌与聚磷菌对碳源的争夺。
为获得较高的脱氮效果,常采用较大的硝化液流比,根据脱氮率η与混合液回流比RN的关系式η=RN/(1+RN)[6],如果以硝化液回流比400%为上限,那么脱氮理论上的最大效率也仅为80%。
且大的回流比使更多的硝酸盐进入到厌氧池进行反硝化处理,造成回流混合液中溶解氧破坏了缺氧硝化环境。
溶解氧的存在抑制了异养硝化盐还原反应,其作用机理为:
氧阻碍硝酸盐还原酶的形成(有些反硝化细菌必须在厌氧和有硝酸盐存在的条件下才能诱导合成硝酸盐还原酶);
氧可作为电子受体,竞争性地阻碍硝酸盐的还原。
1.1.3污水再生全流程的提出
既然N、P不可能在一个反应器内同时深度去除,那么就应该在不同的反应器中分步实现。
与化学除磷相比,生物除磷有很大的优势,由于不投加药剂,可以节省大量运行费用,而且在生物除磷的同时又可以去除有机物,因此可以强化生物除磷单元,实现磷和有机物的深度去除,这也完全符合低碳经济的目标。
由于在生物除磷的同时也去除了大量有机物,在不投加碳源的前提下,脱氮单元的工艺就应该采用以自养脱氮工艺为核心的一系列脱氮工艺。
20世纪90年代发现的厌氧氨氧化(ANAMMOX)现象为这一设想提供了可能性。
张杰、李冬等研究者[7,8]通过对城市污水再生全流程理念进行研究,研发能够高效低耗地去除COD、磷和氮等污染物的处理单元及关键技术,在此基础上将各处理单元进行耦合优化,最终确立了以生物除磷、除有机物单元为首,后接自养脱氮单元的一套较为经济高效的城市污水再生全流程[8],如图1.1所示。
图1.1城市污水再生全流程
1.1.4生物除磷机理
对于生物除磷机理的探寻是环境工程领域最热门的研究课题之一。
自生物除磷设想的提出至今,生物除磷原理的研究得到了长远发展,其具体发展历程如表1.1所示。
表1.1生物除磷研究进展
时间
人物
研究成果
1955
Greenburg[9]
首先提出除磷设想:
活性污泥吸收超过其自身正常生长所需要的磷,进而将污水中的磷转移到剩余活性污泥中最终去除。
1959
Srinath等[10]
最先报道了利用活性污泥来快速去除污水中磷的现象,并发现磷的去除量与曝气强度有关。
1965
Levin和
Shapiro[11]
证实了上述磷的去除是生物代谢所致,并提出碳源的投加有利于微生物对磷的过量摄取,且曝气时间的延长会导致磷的释放。
1975-
1976
Barnard[12,13]
在前人研究的基础上,指出了生物除磷过程中厌氧/好氧(anaerobic/oxic,A/O)交替的必要性,认为硝酸盐会对生物除磷产生抑制作用,无溶解氧(DO)和硝酸盐的厌氧段的存在是除磷能力得到发挥的必要条件,并于1976年提出了Phoredox(phosphorusreductionoxidation)工艺,标志着A/O生物除磷工艺的诞生。
1978
Osborn和
Nicholls[14]
在硝酸盐异化还原过程中观测到了磷的快速吸收现象,即反硝化除磷现象。
1982
Rensink等[15]
建立起释磷与吸磷之间的关系,并提出在A/O生物除磷工艺中的厌氧段可为好氧的聚磷微生物(即聚磷菌,PAOs)提供挥发性有机酸,从而使PAOs在与其他异养菌的竞争中处于优势。
1985
Lotter和
Murphy[16]
证实了反硝化聚磷菌(DPB)的存在,并指出DPB能够以NO3-为电子受体,在吸磷的同时将NO3--N转变为N2。
1986
Comeau等[17]
在前人提出的交替式磷的厌氧释放及好氧同化吸收原理的基础上,从能量代谢的角度提出了污水强化生物除磷(EBPR)的微生物学机理
之后,随着分子微生物学的发展,对于除磷细菌的微生物生态学研究得到不断深入。
纵观整个生物除磷研究进展,在A/O生物除磷工艺确立之前,人们一直致力于传统生物除磷机理的研究,而在反硝化除磷现象发现之后,人们逐渐热衷于反硝化除磷机理的研究。
1.1.4.2传统生物除磷机理传统的生物除磷机理[18]可以概述为一句话:
聚磷微生物在厌氧条件下释放磷,在好氧条件下过量吸收磷,通过定期排泥来达到除磷的目的。
具体来说:
在厌氧的条件下,聚磷菌(PAOs,poly-phosphate-accumulatingorganisms)把细胞中的多聚磷酸盐水解为正磷酸盐释放胞外,并从中获取能量,并利用污水中易降解的有机物,如挥发性脂肪酸(VFA),合成储能物质聚β-羟基丁酸(PHB)等储于细胞内,在好氧的条件下,利用O2为最终电子受体氧化细胞内PHB获得能量,并利用该反应产生的能量,过量从污水中摄取磷酸盐,合成高能ATP,其中一部分又转化为多聚磷酸盐,作为能量储于细胞内,好氧吸磷量大于厌氧释磷量,通过排放富磷污泥来实现高效除磷目的。
1.1.4.3反硝化除磷机理近年来,随着除磷研究在微生物学领域的深入,人们发现这样一种微生物,不仅能够利用氧为电子受体,也可以利用硝态氮或亚硝态氮为电子受体。
在厌氧条件下,这种微生物与好氧聚磷菌一样,储存PHB,释放磷;
在缺氧(无氧但存在硝态氮或亚硝态氮)条件下能够利用硝态氮或亚硝态氮作为电子受体,过量吸收磷,而且在吸磷的同时,硝态氮被还原为氮气,实现同时反硝化和除磷,这种微生物被称之为“反硝化聚磷菌”(denitrifyingphosphorusremovingbacteria,DPB)[19]。
而DPB在缺氧环境下摄磷的这一现象,使得摄磷和反硝化(脱氮)这两种不同的生物过程借助同一种细菌在同一过程完成。
总的来说,生物除磷机理可归纳如图1.2所示。
图1.1生物除磷机理
1.1.5除磷工艺的选择
考虑到反硝化除磷工艺现在并不成熟,对其研究还停留在实验研究阶段,工程实际应用研究有待进一步发展[19]。
并且作为城市污水再生全程后续工艺的自养脱氮单元对氨氮浓度有要求,除磷单元应尽可能少的减小氮素损失。
以及反硝化除磷需要利用硝态氮或亚硝态氮作为电子受体完成磷的吸收,而城市生活污水中其含量几乎为零。
所以全流程的除磷单元不采用反硝化除磷。
表1.1典型的传统生物除磷工艺
工艺名称
主要原理
主要特点
A/O
工艺
厌氧条件下,聚磷微生物将污水中的有物转化为体内的PHB,同时释磷;
在好氧条件下,聚磷微生物以游离氧为电子受体,过量吸收水中的磷。
工艺流程简单,不需要投加化学药品;
建设费用和运行费用均较低。
存在的题是脱磷效果决定于剩余污泥排放量,在二沉池中还难免有磷的释放。
A2/O
在A/O工艺中增设了缺氧池,使好氧池流出的部分混合液回流至缺氧池前端,以达到硝化脱氮的目的。
工艺将生物除磷、脱氮融为一体,流程简单,易于管理;
脱氮时不需要额外投加碳源,运行费用较低。
存在固有缺欠,很难同时取得好的脱氮、除磷效果。
Bardenpho
工艺[20]
循环利用内碳源,尽量利用了微生物的胞内碳源物质,又称A/O-A/O工艺。
有较好的脱磷效果,但是在二沉池中会有磷的释放,工艺流程长、构筑物多,运行费用高。
UCT
工艺[18]
将A2/O工艺二沉池的回流污泥回流到缺氧池而非厌氧池,回流污泥中携带的硝态氮盐在缺氧池中反硝化脱氮后,部分污泥回流进人厌氧池,减少了硝酸盐在厌氧区对释磷的不利影响。
除磷效果得到增强,但工艺流程比较复杂,回流次数和回流量大,增加了能耗和运行费用。
氧化沟类工艺
由于工艺的特殊性,使其在空间或时间布局上存在厌氧、缺氧和好氧区,利用厌氧/好氧交替的原理达到的除磷的目的。
在运行情况良好的基础上,氧化沟工艺的除磷率较高。
但其占地面积较大,能耗较高。
典型的传统生物除磷工艺如表1.2所示。
相比较其它工艺存在的工艺流程复杂,构筑物多,能耗大,运行维护费用高等问题,A/O工艺具有工艺流程简单,不需要投加化学药品,建设费用和运行费用均较低等突出优势。
因而,将A/O生物除磷工艺作为全流程的首端处理单元,实现磷和有机物的深度去除。
1.2A/O除磷研究现状
传统A/O工艺作为一种较为成熟的以去除磷和有机物为主的活性污泥法已有数十年的发展历史,因其良好的除磷效果和可调控性高、不易发生污泥膨胀等诸多优点,该工艺被广泛用于各级污水处理厂中。
国内外对于工艺本身运行机理及相关调控方法的研究也比较多,归纳起来研究内容大体可分为三部分:
1.2.1提高磷去除率的研究
通过调控运行参数,优化实时监测等措施,进一步提高磷的去除率。
如大连经济开发区水质净化厂原采用A2/O工艺,后来进行了厌氧/好氧活性污泥除磷技术改造。
实际运行结果表明:
改造后出水磷含量稳定于1.0mg/L以下[21],然而,水厂将好氧段出水DO控制在为3-3.5mg/L,动力消耗较大,存在过量DO通过回流污泥进入厌氧池的风险。
李捷,熊必永,张杰等[22,23]提出在A/O生物除磷工艺的影响因子中进水COD/TP与生化反应系统的BOD负荷是关键。
其试验结果表明:
COD/TP越大,厌氧释磷越多,越有利于除磷,厌氧释磷量是吸收COD量的函数,但是研究表明:
进水COD/TP的变化对系统COD的去除不会产生明显的影响,试验通过对比不同COD/TP水平和BOD负荷下的除磷效果,明确了两因素对于除磷的影响关系,其试验结果对本课题中A/O除磷工艺的运行具有指导作用。
马菲菲,吴志超,周振等[24-27]以长距离输送的合流制污水为进水,考察不同污泥回流比下A/O工艺对COD、N、P的去除效果,深入研究污泥回流比对生物除磷代谢过程的影响。
污泥回流比对COD及NH4+-N的去除没有明显影响,但对TN、TP、PO43--P的去除影响较大。
随着污泥回流比的增大,PAOs的厌氧释磷量逐渐减小,磷的去除率逐渐降低。
减小污泥回流比,可延长A/O工艺厌氧池实际HRT,增加PAOs在厌氧池可有效利用的碳源,使PAOs在厌氧池充分释磷,从而提高除磷效率。
但是,其实验用水中污染物浓度低于常规城市生活污水,实验结果具有一定的局限性。
郑燕清,周建华等[28,29]通过静态试验考察聚磷菌的厌氧释磷和好氧吸磷情况。
在厌氧状态、低有机负荷率的条件下,污泥释磷的速率随有机负荷率的升高而增加,但当有机负荷率超过临界数值0.12gCOD/gMLSS后有机负荷率不再成为聚磷菌厌氧释磷的限制性因素。
此外,试验考察了硝态氮的存在对厌氧释磷和后续好氧吸磷的影响,发现硝态氮的存在不利于PAOs的厌氧释磷,从而限制了其在后续好氧环境下的吸磷效果,但是其硝态氮浓度维持在24-25mg/L左右,并不具有普遍代表性。
此外,研究者还证实了DO浓度对PAOs好氧吸磷的速率具有影响等。
1.2.2除磷微生物特征的研究
利用微生物技术培养、分离、提纯特定的PAOs并研究其微生物特征,从微观上完善生物除磷技术。
如刘亚男,于水利,薛罡等[30-32]在生物除磷污泥中首次筛选和提纯出产碱杆菌属的聚磷菌,并证明其具有较好的强化除磷效果。
孙源,范琛等[33]采用A/O方式运行的SBR反应器对回流污泥进行诱导驯化,结果表明:
在较短时间内系统有明显的聚磷特征,A/O方式运行的反应器除磷效率大于95%,从运行稳定的系统中进行微生物的分离,经过数次分离得到纯种的菌株,通过染色实验表明菌体内含有异染颗粒。
然而,上述PAOs均来自于SBR反应器中,由于SBR与连续流在运行方式上截然不同,并不能保证该菌株适用于连续进水和出水的传统A/O工艺。
JohwanAhn等人[34]研究了能够以硝酸盐作为电子受体进行生物除磷的DPAOs的特征和微生物多样性。
3个SBR反应器在三种不同电子受体的条件下运行——只有氧气,氧气和硝酸盐一同作为电子受体和只有硝酸盐作为单独电子受体。
通过对PCR-DGGE的结果进行分析,发现不同类型的电子受体下,微生物群落发生改变。
Rhodocyclussp.(96%相似度)和Dechlorimonassp.(97%相似度)包含在所有反应器中,通过DGGE条带的序列分析和系统从属关系判断,它们属于β-Proteobacteria。
于水利等人[35]调查了在不同碳源下,三个SBR反应器中的微生物群落。
分别投加污水,葡萄糖和乙酸钠,获得了较好的除磷效果。
PCR-DGGE分析结果表明,β-protebacteria,Actinomycessp和γ-protebacteria只存在于污水为碳源的反应器。
其微生物多样性超过了另外两个反应器。
Bacillales,Actinomyces,Actinobacteridae和unculturedbacteria可以在生物除磷反应器中被找到。
1.2.3污泥膨胀等异常现象的研究
研究A/O工艺在实际运行中由各种因素引起的污泥膨胀等异常现象。
如杜英豪[36]、卢晓晶等[37]结合污水处理厂的实际运行经验分析了由进水高硫化物、F/M偏低、低溶解氧以及反硝化等因素引起的污泥上浮与膨胀现象,并提出了诸多切实可行的调控措施。
但是,由于污泥膨胀的成因复杂,影响因素较多,通常是多因素共同影响导致污泥性状变差,而且膨胀极易出现反复,所以,对于污泥膨胀等污水处理中的异常现象仍需进一步研究。
1.3全流程赋予A/O的新特点
全流程系统将A/O工艺作为首端处理单元进行生物除磷和去除有机污染物,
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