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味道微咸,是微生物生长很普遍应用的有机氮源,它还能促进青霉素等抗生素的生物合成。
培养基设计的基本原则
1)培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素,并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量
2)营养成分恰当的配比
3)渗透压(吸收、传质)
4)pH值
5)氧化还原电位(如:
专性厌氧菌)
如何进行培养基的设计
(1)理论计算法
碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物+CO2+H2O+热量
通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需的营养物的最低数量。
(2)组成微生物的元素包括C、H、O、N、S、P、Mg和K(见下表),这些元素都要在方程式中予以平衡
(3)有些微生物无力的合成特定营养物,如氨基酸、维生素或核苷酸。
一旦测出其中一种是生长因子,就要在培养基中加入适量的纯净的化合物或含有该物质的混合物。
(4)碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用,在需氧条件下,对碳源的需要量可以从菌体对底物的产率系数(Yx/s)推算而得。
发酵培养基的组成成分
水碳源氮源无机盐维生素缓冲剂前体和代谢调节剂消沫剂
促进剂:
不促进微生物的生长、只是有助于调节产物的形成
抑制剂:
加入后会抑制某些代谢途径,使另一途径活跃,从而获得人们需要的代谢产物
预处理的必要性
1,发酵工厂在进行生产前,必须先将原料中混杂的杂质除去,保证后续工序生产的正常和顺利进行
2,为保证后续工序生产的正常和顺利进行,还需对原料进行适当加工
3,为保证生产环境的清洁,必须采用适当的输送方式将原料从仓库运送至配料罐或反应器。
预处理的方法(方式)
1,原料除杂
•筛选•风选•磁力除铁
2,原料的粉碎
(1)粉碎的目的:
•增加原料受热面积
•粉末状原料加水混合后容易流动输送
•对于一些带壳的原料,如高粱、大麦,在粉碎前,则要求先把皮壳破碎
(3)粉碎方法
•干粉碎
粗砰常用的设备是轴向滚筒式粗碎机,也有用锤式粉碎机进行粗碎的例子,常用的细碎设备是锤式粉碎机
•湿粉碎
湿法粉碎工艺的优点
•彻底消除了粉尘的危害,改善了劳动条件,降低了原料的损耗
•提高了原料的粉碎细度
•节省了蒸煮时所消耗的蒸气
•粉碎机部件(特别是刀片)的磨损减少
•设备简单,对厂房要求不高
(1)机械的输送
(2)气流输送
优点•设备简单•占地面积小•费用少
•连续化自动化改善了劳动条件
•输送能力和距离有较大的变动范围
•在气流输送的同时,还可对物料进行加热、冷却、干燥等操作
原理:
•气流输送方法,是借助气流的动能,使管道中的物料被悬浮输送。
气流输送的流程
•吸引式流程(真空输送)
•压送式流程(压力输送)
流程的比较
•吸引式流程,不需加料器,但要有封闭较好的排料器;
•压送式流程,不需排料器,但要有封闭较好的加料器;
•对相同输送量,压送式流程较吸引式流程采用较细的管道;
•从几个不同的地方,向一个卸料点时,吸引式流程较适合;
从一个加料点向几个不同地方送料时,压送式流程较适合
淀粉在水-热处理过程的中变化
(1)水-热处理的概念•将淀粉质原料与水一起,在高温高压或低温低压的条件下进行处理的过程。
(2)水-热处理的目的•淀粉原料经过水热处理,使淀粉从细胞中游离出来,并转化为溶解状态,以便淀粉酶系统进行糖化作用,这就是原料水-热处理的主要目的。
淀粉的膨胀和溶解
•膨胀:
淀粉是一种亲水胶体,遇水加热后,水分子渗入淀粉颗粒的内部,使淀粉分子的体积和重量增加,这种现象称为膨胀。
•糊化:
在温水中,当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象,称为淀粉的糊化。
此时的温度称为糊化温度。
溶解或液化:
淀粉糊化后,如果提高温度至130℃,由于支链淀粉的全部(几乎)溶解,网状结构彻底破坏,淀粉溶液的粘度迅速下降,变为流动性较好的醪液,这种现象称为淀粉的溶解或液化。
淀粉的老化
液化后的淀粉醪液在温度降低时,黏度逐步增加,重到重新发生结晶的现象,称为老化
焦糖化:
当温度达到糖的熔点时(185℃),糖分脱水形成黑色无定形物,统称焦糖
氨基糖反应:
还原糖与氨基酸之间产生的呈色反应称为氨基糖反应。
酶解法液化、糖化淀粉常用的酶
•α-淀粉酶:
其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖,对淀粉的作用,可将长链从内部分裂成若干短链的糊精,所以也称内切淀粉酶。
淀粉受到α-淀粉酶的作用后,遇碘呈色很快反应,如下表现:
蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)
•糖化酶:
作用于淀粉的l,4键结合,能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断,因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖,所以称为外切淀粉酶。
•β-淀粉酶:
β-淀粉酶能水解α-1,4糖苷键,不能水解α-1,6糖苷键,遇此键水解停止,也不能越过继续水解。
β-淀粉酶届于外切酶,水解产物只有麦芽糖。
•异淀粉酶:
异淀粉酶能水解支链淀粉和糖原分子中支叉地位的α-1,6糖苷键,使支叉结构断裂。
但对于直链结构中的α-1,6糖苷键却不能水解。
•普鲁蓝酶能水解支叉结构和直链结构的α-1,6糖苷键、支链淀粉、糖原和其β-极限糊精及普鲁蓝分子中的β-1,6键。
脱支酶——普鲁兰酶vs异淀粉酶
•普鲁兰酶类型的淀粉脱支酶和异淀粉酶类型的淀粉脱支酶都能够专一地切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键,将小单位的支链分解,从而切下整个侧枝,最大限度地利用淀粉原料。
•其不同在于:
普鲁兰酶作用底物的最小单位是2个麦芽糖基含1个α-1,6-糖苷键
•异淀粉酶作用底物的最小单位是麦芽三糖基或麦芽四糖基含1个α-1,6-糖苷键,不能水解只有2个葡萄糖基的α-1,6-糖苷键。
表现为前者以普鲁兰和支链淀粉为底物,不能作用于植物和动物糖原;
后者能够去除支链淀粉和植物、动物糖原中的分支链,却不能作用于普鲁兰。
•异淀粉酶类型的淀粉脱枝酶相较普鲁兰类型的淀粉脱枝酶具有诸多优点,首先它能同时从内部和外部水解支链淀粉的分支点;
其次它的催化反应具有不可逆性;
再者,异淀粉酶的催化活性不会被麦芽糖所抑制
DE值:
糖化液中还原糖含量(以葡萄糖计)占干物质的百分率,用以表示淀粉糖的糖组成。
还原糖用斐林法或碘量法测定,干物质用阿贝折光仪测定。
酶法液化方法
•升温液化法-间歇式
工艺:
将浓度30~40%淀粉乳调整pH到6.5,加入CaCl2(0.01mol/L)和一定量淀粉酶(5~8u/克淀粉),剧烈搅拌,加热到85~90℃,保持30~60分钟,达到液化程度(DE15~18),升温到100℃,灭酶10分钟。
此方法简便,但效果较差,能耗大,原料利用率低,过滤性能差。
•高温液化法(喷淋连续进出料液化法)-半连续式
将淀粉乳调整到适当pH和Ca2+浓度,加入一定量的液化酶,用泵打给喷淋头引入液化罐中(其中已有90℃热水),淀粉糊化后,立即液化,至保温罐90℃保温40分钟,达到液化的程度。
优点:
设备和操作简单,效果比间歇液化好。
缺点:
不安全,蒸汽耗量大,温度无法达到最佳温度,液化效果差,糖液过滤性能也差
•喷射液化法-连续式
利用喷射器将蒸汽直接喷射至淀粉薄层,以在短时间内达到要求的温度,完成糊化和液化。
喷射后,进入保温罐,85~90℃保温45分钟。
优点:
设备小,便于连续操作,原料利用率高,转化率高,蛋白质凝聚好。
但要求一定压力的蒸汽,进出料的速度要稳定。
液化程度的控制
•淀粉液化的目的:
为糖化酶作用创造条件;
合适的分子大小适合糖化酶作用
•碘试/测定DE值(DextroseEquivalent)
•正常DE值10~20(糊精、低聚糖、单糖)
–DE值高,糊精太小,不利于糖化酶作用,影响催化效率,终点DE值低。
–DE值低,液化不彻底,糖化速度慢,酶用量大,时间长,过滤性能差。
•透光率和澄清度
液化效果的标准
•液化要均匀
•蛋白絮凝效果好(灭酶,100℃/10min)
•液化彻底(60˚C时液化液要稳定,不出现老化现象,不含不溶性淀粉颗粒,液化液透明、清亮)
糖化理论
•糖化:
以无机酸或酶为催化剂,在一定温度下使淀粉水解,将淀粉全部或部分转化为葡萄糖等可发酵性糖的过程。
•糖化剂:
糖化过程中所用的催化剂。
包括无机酸和酶。
•糖化的目的:
将淀粉转化为可发酵性糖。
•理论收率(111.11%)
•实际收率(105%~108%)
•淀粉转化率
淀粉水解过程的反应
•主反应:
糖化(水解作用)
•副反应:
–复合反应(在酸和热作用下,部分葡萄糖经1,6键结合成龙胆二糖,异麦芽糖和其他低聚糖。
)
–分解反应(葡萄糖分解为羟甲基糠醛,有机酸和有色物质等非糖产物)
糖化的过程检测
•检验液化:
是否有淀粉,用碘液,是否呈兰色;
•检验糖化:
是否水解完全
–测定还原糖;
–用无水酒精。
(1)酸解法(酸糖化法)
•定义:
以酸(无机酸或有机酸)为催化剂,在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。
•优点:
–工艺简单,设备较单一
–水解时间短,设备周转快
•缺点:
–需耐高温、高压和耐腐蚀的设备
–副产物多,淀粉的转化率低–对原料要求高
–废水难处理
(2)酶解法
以酶为催化剂,在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。
包括液化和糖化两个过程,故又称双酶水解法。
–反应条件温和
–副反应少,淀粉质量高
–可在较高淀粉浓度下水解,对预料要求不高
–糖液的质量高、营养物质较丰富
–水解时间长,夏天糖液容易变质
–设备较多
糖化方法的比较
•水解时间:
酸法短,酶法长
•水解程度:
酶法高
•糖液杂质:
酶法低,酸法高
酶法糖化的工艺流程
液化→糖化→灭酶→过滤→贮糖计量→发酵•工艺要点:
–糖化pH4.2-4.5
–温度60℃左右
–糖化酶用量150U/g淀粉
–糖化时间32小时,用无水酒精检验无糊精存在时,糖化结束,然后将pH调整至4.8-5.0,维持20分钟灭酶
水解糖液的质量要求和控制要点
(1)水解糖液的质量要求
•色泽:
呈强黄色透明液
•糊精反应:
无
•还原糖含量,18%左右
•DE值:
90%以上
•透光率:
60~80%左右(650纳米)
•pH值:
4.6~4.8
•淀粉转化率:
92%以上(实际产量/理论产量)
(2)水解糖液的控制要点
•合理控制淀粉乳浓度
•糖液要清
•溶液中不含糊精
•糖液要新鲜
•糖液贮存容器一定要保持清洁,定期清理和清洗,防止酵母菌等浸入
纤维质原料的预处理
•物理方法有:
–剪切和研磨–高温液态法–高温分解–微波处理–蒸汽爆破–高能辐射
•常用的化学法有:
–臭氧法–酸水解法–碱法–氧化脱木素法–有机溶剂法
•常用的物理化学法有:
–蒸汽爆裂法–氨纤维爆裂–CO2爆破法–蒸汽爆裂与乙醇抽提结合法–氨冷冻爆破法
生物合成的前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中,能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去,其自身结构并无多大变化,但产量却因前体的加入有较大提高。
•灭菌:
用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物,包括营养细胞、细菌芽孢和孢子
•消毒:
用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。
工业上具体措施包括:
1)使用的培养基和设备须经灭菌;
2)好氧培养中使用的空气应经除菌处理;
3)设备应严密,发酵罐维持正压环境;
4)培养过程中加入的物料应经过灭菌;
5)使用无污染的纯粹种子。
培养基灭菌的目的•杀灭培养基中的微生物,为后续发酵过程创造无菌的条件。
培养基灭菌的要求
•达到要求的无菌程度(10-3)
•尽量减少营养成分的破坏,在灭菌过程中,培养基组分的破坏,是由两个基本类型的反应引起的:
–培养基中不同营养成分间的相互作用;
–对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
湿热灭菌的原理
每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。
当微生物处于最低温度以下时,代谢作用几乎停止而处于休眠状态。
当温度超过最高限度时,微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性,使微生物在很短时间内死亡,加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。
湿热灭菌中的相关定义
•杀死微生物的极限温度称为致死温度。
在致死温度下,杀死全部微生物所需的时间称为致死时间;
在致死温度以上,温度愈高,致死时间愈短。
•微生物的热阻:
是指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。
相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
湿热灭菌的优点
•蒸汽来源容易,操作费用低,本身无毒;
•蒸汽有强的穿透力,灭菌易于彻底;
•蒸汽有很大的潜热;
•操作方便,易管理。
保证间歇灭菌成功的要素
•内部结构合理(主要是无死角),焊缝及轴封装置可靠,蛇管无穿孔现象
•压力稳定的蒸汽
•合理的操作方法
连续灭菌的流程
喷射加热-真空冷却流程
板式换热器灭菌流程
连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程
维持罐
灭菌系统中的维持设备,主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间,以达到灭菌的目的,也称保温设备
喷射加热器
可使料液和蒸汽迅速接触,充分混合,加热是在瞬时内完成的。
连续灭菌的优缺点
•优点
–保留较多的营养质量
–容易放大
–较易自动控制;
–糖受蒸汽的影响较少;
–缩短灭菌周期;
–在某些情况下,可使发酵罐的腐蚀减少;
–发酵罐利用率高;
–蒸汽负荷均匀。
•缺点
–设备比较复杂,投资较大。
分批灭菌的优缺点
–设备投资较少
–染菌的危险性较小
–人工操作较方便
–对培养基中固体物质含量较多时更为适宜
–灭菌过程中蒸汽用量变化大,造成锅炉负荷波动大,一般只限于中小型发酵装置。
发酵罐的灭菌
培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。
则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。
在保温结束后,关键是随即通入无菌空气,使容器保持正压,防止形成真空而吸入带菌的空气。
不同种类的杂菌对发酵的影响
•青霉素发酵:
污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大
•链霉素发酵:
污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大
•四环素发酵:
污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大
•柠檬酸发酵:
最怕污染青霉菌
•肌苷、肌苷酸发酵:
污染芽孢杆菌的危害最大
•谷氨酸发酵:
最怕污染噬菌体
•高温淀粉酶发酵:
污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大
不同染菌时间对发酵的影响
•种子培养期染菌:
菌体浓度低、培养基营养丰富
•发酵前期染菌:
杂菌与生产菌争夺营养成分,干扰生产菌的繁殖和产物的形成
•发酵中期染菌:
严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成
•发酵后期染菌:
如杂菌量不大,可继续发酵。
如污染严重,可采取措施提前放罐
不同染菌途径对发酵的影响
•种子带菌:
种子带菌可使发酵染菌具有延续性
•空气带菌:
空气带菌也使发酵染菌具有延续性,导致染菌范围扩大至所有发酵罐
•培养基或设备灭菌不彻底:
一般为孤立事件,不具有延续性
•设备渗漏:
这种途径造成染菌的危害性较大染菌对产物提取和产品质量的影响
•对过滤的影响:
发酵液的粘度加大
菌体大多自溶
由于发酵不彻底,基质的残留浓度增加
•造成的后果:
过滤时间拉长,影响设备的周转使用,破坏生产平衡
大幅度降低过滤收率
•对提取的影响
有机溶剂萃取工艺:
染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质,易发生乳化,使水相和溶剂相难以分开
离子交换工艺:
杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附,大大降低离子交换树脂的交换量
•对产品质量的影响
对内在质量的影响:
染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。
对产品的纯度有较大影响。
(内毒素、热原)
对产品外观的影响:
一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液,放置后会出现混浊,影响产品的外观。
目前生产上常用的杂菌检查方法有:
①显微镜检查:
染色镜检
②平板划线检查:
倒平板空培养待测样品划线培养观察
③酚红肉汤培养检查:
无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察
•判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据•无菌试验的目的:
1,监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底
2,监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入
3,了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角
各种检查方法的比较
•显微镜检查方法简便、快速,能及时发现杂菌,但由于镜检取样少,视野的观察面也小,因此不易检出早期杂菌。
•平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果,且操作较繁琐,但它要比显微镜能检出更少的杂菌,而且结果也更为准确
从染菌的规模来分析染菌原因
•大批发酵罐染菌:
空气系统
•部分发酵罐(或罐组)染菌:
前期可能是种子带杂菌,或灭菌不彻底,中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的
•个别发酵罐连续染菌:
设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损),设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象
•个别发酵罐偶然染菌:
原因比较复杂,因为各种染菌途径都可能引起。
从染菌的时间来分析
•发酵早期染菌:
种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角
•中、后期染菌:
中间补料、设备渗漏、操作不合理
从染菌的类型来分析
•耐热性芽抱杆菌:
死角或灭菌不彻底
•球菌、酵母:
可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的
•浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌):
发酵罐的冷却管或夹套渗漏
•霉菌:
灭菌不彻底或无菌操作不严格
种子带菌的原因
•无菌室的无菌条件不符合要求
•培养基灭菌不彻底
•操作不当
种子摇瓶培养的注意事项
•保证摇瓶间的清洁卫生
•摇瓶内液体装料不宜过多
•瓶口包扎的纱布一般为八层以上
设备渗漏的原因
•发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀
•磨蚀
发酵液中固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损
冷却介质和加热时蒸汽的冲击,引起管内壁的磨损
•设备加工不良
弯管时,弯头处管壁变薄
焊接不良
盘管渗漏的防止
•放罐后要认真清洗发酵罐
•控制冷却水质量,降低其中氯离子含量
•对盘管定期检查、试漏,及时发现漏隙
•试漏方法
–气压试验:
先在发酵罐内放满清水,用压缩空气通入管子,观察水面有无气泡产生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位。
–水压试验:
用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管,泵到一定压力时,观察管子有否渗漏现象
防漏
在发酵罐底的出料阀门和空气管道连接的蒸汽管道上的阀门,可安装双重阀,其优点是:
即使阀门1有渗漏,蒸汽也可通过阀门3排除
隔膜阀有以下优点:
•严密不漏。
•无填料。
•阀结构为流线型,流量大,阻力小,无死角,无堆积物,在关闭时不会使紧密面轧坏。
•检修方便。
但须定期检查隔膜有否老化及脱落。
膜隔阀的缺点:
•制造不够精密;
体积较大,在管道上占用较大的面积和空间。
•中心易引起渗漏。
•隔膜阀开关费力,需要借助扳手。
•橡胶隔膜是橡胶和帘布复合制成,如质量不好,帘布与橡胶易脱落,固定隔膜的螺栓也易脱落。
管路的连接
•螺纹连接
•法兰连接
•焊接
死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。
染菌后的挽救措施
•种子培养或种子罐中发现污染。
•发酵早期染菌可以适当添加营养物质,重新灭菌后再接种发酵。
•中后期染菌,如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时,应该提早放罐。
•有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多,如果提早放罐,这些物质会影响后处理提取使产品取不出,此时应先设法使碳、氮源消耗,再放罐提取。
引起噬菌体感染的原因
•设备的渗漏
•空气系统、培养基灭菌不彻底
预防噬菌体感染的措施
•发酵罐的排气管要用汽封或引入药液(如高锰酸钾、漂白粉或石灰水等溶液)槽中。
•取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道。
•把好种子关,实现严格的无菌操作。
•搞好生产场地的环境卫生。
车间四周要经常进行检查,如发现噬菌体即时用药液喷洒。
感染噬菌体后采用的理方法
•选育抗性菌株。
•轮换使用专一性不同的菌株。
•加化学药物(如谷氨酸发酵可加2~4ppm氯霉素,0.1%三聚磷酸钠,0.6%柠檬酸钠或铵等)。
•将培养液重新灭菌再接种(
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