《化工原理》实验教学大纲Word格式.docx
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实验成绩评分办法:
实验技能占40%,实验态度占20%,实验报告
占20%,实验室常识占20%。
四、实验项目一览表
生物化学与分子生物学综合实验项目一览表
序
实验类型
实验要
求
适用专业
学
时
号
实验项目名称
1
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
设计性
必做
农科类、植保、工程类
3
蛋白质含量测定(双缩脲法)
2
蛋白质含量测定(Folin酚试剂法)
蛋白质含量测定(紫外吸收法)
淀粉酶活力测定
综合性
6
4
质粒DNA的提取
5
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测
7
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白
质分子量
五、实验项目的具体内容
实验一蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
1、本次实验的目的和要求
学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
2、实验内容或原理
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕褐色,当它与(浓度0~100卩g/ml)蛋白质结合呈蓝
色,颜色随蛋白质浓度的增加而加深,在595nm波长下光吸收和蛋白质浓度成正比。
3、需用的仪器和试剂
试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250
4、实验步骤
标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算
5、教学方式
学生为主,教师辅助,充分预习,独立完成。
6、考核要求
以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核内容。
7、实验报告要求
实验报告应包括下列各项:
(1)报告的题目(要简明确切);
(2)写报告人及共同测定人员的姓名;
(3)实验目的;
(4)实验原理;
(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称);
(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格);
(7)实验结果。
明确提出本次实验的结论,用公式计算。
(8)分析与讨论,要对实验结果做出估计,分析误差大小及原因,对实验中发现的问题应进行讨论,对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏;
(9)回答思考题。
实验二蛋白质含量测定(双缩脲法)
1、本次实验的目的和要求
学习和掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
碱性溶液中双缩脲(NH2-C0-NH-C0-NH)能与Cu2+产生紫红色的络合物,这一反应称为“双缩脲反应”。
蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应,溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯-比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。
其可测定范围为1〜10mg蛋白质,适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。
Tris,—些氨基酸,
EDTA等会干扰该测定。
试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、双缩脲试剂、NaOH
5、教学方式学生为主,教师辅助,充分预习,独立完成。
6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核内容。
7、实验报告要求实验报告应包括下列各项:
(1)报告的题目(要简明确切);
(2)写报告人及共同测定人员的姓名;
(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称);
实验三蛋白质含量测定(Folin酚试剂法)
掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理方法,熟悉分光光度计的操作。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
Folin-酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应:
第一步是在碱性条件下蛋白质与
CuSQ作用生成络合物,第二步是此络合物还原Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂),生成深蓝色的化合物,且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。
该方法灵敏度高于双缩脲法100倍。
3、需用的仪器和试剂
分光光度计、水浴锅、试管、具塞试管、小烧杯、漏斗及架、电子天平、吸管、容量瓶、滤纸、玻棒、研钵、离心机、离心管、Folin-酚试剂
4、实验步骤
7、实验报告要求
实验四蛋白质含量测定(紫外吸收法)
1、本次实验的目的和要求学习用紫外吸收法测定蛋白质含量。
熟悉分光光度计的操作。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基在280nm波长下具有最大的吸收。
由
于各种蛋白质中都含有酪氨酸,因此280nm的吸光度是蛋白质的一种普遍性质。
在一定程度
上,蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比,故可用作蛋白质定量测定。
3、需用的仪器和试剂紫外分光光度计,离心机,电子天平,研钵,容量瓶,刻度吸管
(1)取4ml的豆菜提取液,在紫外分光光度计上,于280nm和260nm波长下分别测其吸光度。
(2)根据公式计算出蛋白质含量:
蛋白质(卩g/ml)=(1.45A280-0.74A26。
)X稀释倍数
(8)分析与讨论,要对实验结果做出估计,分析误差大小及原因,对实验中发现的问题
应进行讨论,对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏;
实验五淀粉酶活力测定
学习酶活力测定的一般方法,巩固并熟练分光光度计的使用。
淀粉酶主要包括a-淀粉酶、B-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶。
a-淀粉酶随机作用于
直链淀粉和支链淀粉的直链部分a-1,4糖苷键,单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、a-极
限糊精和少量葡萄糖。
它比较耐热但不耐酸,pH3・6以下可使其钝化。
淀粉酶从非还原端作用于a-1,4糖苷键,遇到支链淀粉的a-1,6键时停止。
单
独作用时产物为麦芽糖和极限糊精,70C保温15min可使其钝化。
通常提取液中a-淀粉酶和B-淀粉酶同时存在。
可以先测定(a+B)淀粉酶总活力,然后在70C加热15min钝化B-淀粉酶,测出a-淀粉酶活力,用总活力减去a-淀粉酶活力,就可求出B-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测
定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,生成物
颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活力大小。
电子天平、研钵、容量瓶、具塞刻度试管、吸管、离心机、恒温水浴、分光光度计
1%淀粉溶液、柠檬酸缓冲液、NaOH、3,5-二硝基水杨酸、麦芽糖标准液(1mg/ml)
(1)酶液提取
称取2g萌发3天的小麦种子(芽长1cm左右),置研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸馏水,研成匀浆,无损地转入100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至100ml。
每隔数分钟振荡1次,提取20min。
3000r/min离心10min,转入上清液备用。
(2)标准曲线的制作
取25ml刻度试管7支,编号。
分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达1.0ml,再各加3,5-二硝基水杨酸试剂1.0ml,置沸水煮沸5min。
取出冷却,用蒸馏水稀释至12.5ml。
混匀后用分光光度计再520nm波长下进行比色,记录吸光度。
以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,
绘制标准曲线。
(3)a-淀粉酶活力测定
1取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。
2于每管中各加酶液1ml,在70C恒温水浴中准确加热15min,钝化B-淀粉酶。
取出后
迅速用流水冷却。
3在对照管中加入4ml0.4mol/L氢氧化钠。
4在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
5将4支试管置另一个40C0.5C恒温水浴中保温15min,再向各管分别加入40C下预热的1%淀粉溶液2ml,摇匀,立即放入40C恒温水浴准确记时保温5min。
取出后向测定管
迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。
(4)淀粉酶总活力测定
取4支试管编号,2支为对照,2支为测定管。
然后加入提取的酶液1ml。
在对照管加入4ml0.4mol/L氢氧化钠。
4支试管中各加1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
以下步骤重复a-淀粉酶测定第⑸步的操作,同样准备测糖。
(5)样品的测定:
取步骤2,3中酶作用后的各管溶液1ml,分别放入相应的4支25ml具
塞刻度试管中,各加入1ml3,5—二硝基水杨酸试剂。
以下操作同标准曲线制作。
根据样品比色吸光度,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。
实验六质粒DNA的提取
通过该实验使学生掌握质粒培养的方法,条件(包括培养基的配制、灭菌、接种、培养)、以及提取质粒的方法。
从大肠杆菌中提取质粒DNA勺方法很多,其中的碱性SDS法提取质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异而予以分离的。
在强碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA
均变性(双链解开)。
由于质粒DNA是共价闭合环状超螺旋结构,变性后两条互补链不会完全
分开。
当溶液pH调节到中性时,质粒DNA容易复性并溶解在溶液中,而染色体DNA不容易
复性,互相缠绕,在离心时极易和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。
转移出上清液,再用乙醇沉淀出其中的质粒DNA。
以具有质粒pETblue-2的大肠杆菌实验材料,用碱性SDS法可从该菌体中提取到质粒
DNA经琼脂糖凝胶电泳可以检测出。
3、需用的仪器和试剂高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡摇床、台式高速离心机、真空干燥器、低温冰箱、恒温水浴、移液器、LB培养基、羧苄青霉素(Carb)、四环素(tet)、TE、溶
液I、溶液n、溶液川、无水乙醇、70比醇
(1)先在3mLLB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(Carb,终浓度50ug/mL)和7.5uL四环素(Tet,终浓度12.5ug/mL),然后接入一个含pETBIue—2质粒的大肠杆菌单菌落,37C190r/min振荡培养过夜。
(2)将过夜培养的菌液加入1.5mL小指管管中,4000r/min离心1分钟,吸去培养液将所有菌体细胞收集在一个小指管中。
(3)加入100卩L溶液I于含菌体细胞的小指管中,旋涡振荡将细菌沉淀悬浮,室温放置10分钟。
(4)加入200卩L溶液II(新鲜配制),轻轻混匀内容物,将小指管置于冰上使菌液裂解变清(不可用旋涡震荡器)。
(5)加入150卩L溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻混匀数次。
冰上放置15分钟让质粒DNA复性(不可用旋涡震荡器)。
(6)12000r/min离心10分钟,将上清转至另一1.5mL小指管中。
(7)向上清中加入等体积酚:
氯仿:
异戊醇(去蛋白和脂类),旋涡混匀,12000r/min离心5分钟,将上清转移到另一1.5mL小指管中。
(8)向上清中加入等体积氯仿:
异戊醇(去微量酚和脂类),旋涡混匀,12000r/min离心5分钟,将上清转移到另一1.5mL小指管中。
(9)向上清中加入2倍体积无水乙醇,旋涡混匀后,室温放置30分钟。
12000r/min离心10分钟,吸去上清液。
(10)用1mL75%乙醇洗涤质粒DNA沉淀两次(每次12000r/min离心5分钟),吸去上清液,真空抽干或空气中干燥。
(11)加20卩LTE,使质粒DNA完全溶解,—20C保存。
6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格);
7)实验结果。
明确提出本次实验的结论
8)回答思考题。
实验七质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
掌握电泳鉴定的基本操作技术,为从事基因工程和分子生物学研究奠定初步基础。
琼脂糖凝胶电泳适于分离鉴定200〜20000bp的核酸片段。
在中性pH条件下,核酸带负
电荷,在电场中向正极移动,电泳后,核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。
GoldView是一种可代替溴化乙锭的新型核酸染料,其灵敏度与EB相当,使用方法与之
完全相同,当与DNA吉合后,在紫外透射光下双链DNA呈现黄色荧光,由于未发现GoldView有致癌作用,且灵敏度与EB相当,将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。
琼脂糖、标准分子质量DNA、上样缓冲液(6Xloadingbuffer)、TAE、GoldView电泳仪、水平电泳槽、移液器
(1)将有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封
严,不能留缝隙)。
(2)将有机玻璃内槽放置于水平位置,并放好样品梳子。
(3)将称取0.25g琼脂糖放入三角瓶中,加入25mL1XTAE,用封瓶膜封住三角瓶的上口,在微波炉中将琼脂糖溶化。
(4)待冷到60C左右的琼脂糖凝胶液时,加入2卩LGoldView核酸染料,轻轻混匀,将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)
(5)待胶液凝固后,取下橡皮膏,将机玻璃内槽放入电泳槽内。
(6)加入电泳缓冲液(1XTAE)至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面,轻轻取出梳子。
(7)加样:
DNA样品中按照5:
1的比例添加6X凝胶加样缓冲液(loading-buffer),混合均匀,用移液枪将DNA样品加入样品孔中。
(记录点样顺序及点样量)。
(8)电泳:
接通电泳槽与电泳仪的电源,恒压80V(注意正负极,DNA片段从负极向正
极移动)。
DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。
当溴酚蓝指示剂移动到
距凝胶前沿1〜2cm处,停止电泳。
(9)254nm紫外灯下观察DNA条带的完整性及亮度。
学生为主,教师辅助,充分预习,独立完成。
明确提出本次实验的结论;
(8)回答思考题。
实验八聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测
了解PCR实验原理及操作技术,讲授引物设计的原则,观看PCR课件
PCR是一种在体外扩增的DNA的技术,其基本原理是通过高温使双链DNA解旋成单链,然后退火,使特征引物与互补序列配对,最后在TaqDNA聚合酶的作用下合成DNA片段,经多次循环,直至产生足够的DNA片段。
Khorana等早在1971年就提出PCR概念,但直到1988年Saiki等从真细菌ThurmasaquticusrT1中开发出热稳定的TaqDNA聚合酶并实现PCR技术的完全自动化后,PCR才在生命科学研究领域被广泛用来扩增DNA片段。
PCR技术可在一个酶促反应中产生大量已知序列的DNA片段,简化了克隆、鉴定、修饰核酸等程序。
正是因为具有如此快速、简便、经济、高效的特点,使得PCR技术成为分子生物学研究强有力的技术工具。
酶:
来源TaqDNA聚合酶最适温度90多度,但那时其半衰期短不足以支持30个循环。
所以选择72C作为延伸温度足以支持30个循环。
DNA片段快速扩增的方法:
即通过引物在DNA聚合酶的作用下,延伸核酸某个区域而引起的双向DNA合成。
反应物含有:
(1)模板:
阳性对照
(2)Taq酶:
(3)引物1
(4)引物2
(5)dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
(6)电极缓冲液TAE:
Tris-乙酸
(7)buffer缓冲液含有:
20-24个核苷酸,40%-50%的鸟苷酸、胞苷酸,以及反应所需
的MgCl2。
反应的过程:
变性、扩增、复性、延伸
PCR仪、水平电泳槽、恒压电泳仪、加样器、封口膜、PCR管、台式高速离心机、紫
外检测仪、10XPCR反应液、、中性dNTP、引物1、引物2、DNA模板、Taq酶(2.5U/卩I)、
电泳缓冲液(1xTAE)、琼脂糖、Goldview、DNAMarkers(标准DNA
PCR扩增目的基因(碱性磷酸酶AKP
(1)在0.2mLPCR管内配制50卩L反应体系
2.5mmol/LdNTPMixture4uL10xPCRbuffer5uL
10umol/mLsense2uL
10umol/mLanti-sense2uL
模板DNA1uL
Ex-Taq1uL(1U)
ddH2O35uL
2)按下述程序进行扩增
1)
94
C
预变性
分钟
2)
变性
3)
55
退火
4)
72
延伸
5)
重复步骤
一4)30次
6)
C延伸
10
分钟。
(3)琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
配制0.8%琼脂糖凝胶
30mL(1xTAE,力口1.5ulGoldView。
50卩LPCR扩增产物+6uL10xloading-bufer+6uLSYBR核酸染料,混匀,全部上样电泳,恒压80V。
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