G418筛选稳定表达细胞系Word文档格式.docx

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具体如下：

将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。

而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。

尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。

《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。

细胞系或机体

G418浓度（ug/ml）

中国仓鼠卵巢细胞

700～800

Madin-Darby犬肾细胞

500

人上皮A431细胞

400

猿CV-1细胞

盘基网柄菌属

10～35

植物

10

酵母

125～500

看下面的一个试验：

3×

106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！

加药时间

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；

但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。

这时会出现两个问题：

1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。

2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。

这个时候需要一种特殊的培养液：

假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：

1混合备用。

再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

挑选单克隆的优化

为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。

加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。

然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；

或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。

最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。

鉴定之后

一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。

但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。

但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。

随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。

这样再次筛选是必不可少的。

只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。

Protocal

1.G418的配制：

取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：

取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基：

在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选:

吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：

在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：

用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。

假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！

心得：

由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。

比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200ug/ml。

这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。

a转染：

转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：

4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；

b加G418:

去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

c换液：

当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。

筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；

d挑单克隆：

制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。

在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。

待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

e单克隆鉴定：

细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

常见问题：

1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？

无怪乎两种形式：

整合在染色体中和存在于细胞质中。

没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。

2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起？

整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。

培养基处理的个人技巧

体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。

这个过程也是细胞同化培养基的过程。

细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。

在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。

我是用适应性培养基来解决这一问题的：

适应性培养基的配制

a培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24～48小时后，吸出所有培养液

b离心：

3000～4000rpm10min后，吸取上清液

c虑过：

再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。

eeflying

1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12个级别。

培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

２.我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。

３.即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。

转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。

所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。

操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。

1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。

按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。

neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。

有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。

2.那为什么还要筛选基因？

是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。

打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？

应该是很小的。

红球就是neo，黄球就是你的目的基因。

我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？

用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。

因为二者出现的概率比是恒定的。

3.维持就是只要养这种细胞，就要维持。

可以再低些，但不能没有。

或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。

4.neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。

这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。

5.胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。

仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了

本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓度的一半。

Feynman_R

汇合度（confluence）也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。

最近的一个实验是：

106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细胞的孔会大约50%汇合，而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左右汇合，今天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞！

所以我认为汇合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。

jiangql同意菊花与刀对你的建议。

我的感觉G418筛选时间太长，到后来一般会对细胞生长有影响。

以下是一些建议，供参考：

首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就会全军覆没。

一般5～7天后G418就可以减半维持。

勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。

血清浓度可以高到20％，质量要好。

进行真核转染的一般程序：

克隆目的基因（经测序验证）—准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定

下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。

一、 

试剂准备

1、HBS（Hepes-bufferedsaline）：

876mgNaCl溶于90mlddH2O，加入1MHepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml,pH7.4，滤过除菌。

2、核酸贮存液，过滤除菌。

3、培养基：

含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。

二、操作步骤

（一）克隆目的基因

1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。

2、回收特异性扩增片段，连入T载体。

3、转化DH5α，质粒制备。

4、酶切初步鉴定，测序证实。

（二） 

真核重组表达载体的构建：

pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。

重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切

回收插入片段和pcDNA3线性片段

T4连接酶连接

转化DH5α

质粒制备

BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。

（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：

1、G418筛选浓度测定：

SHG-44培养于24孔培养板→G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。

以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。

2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。

进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。

一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×

105细胞。

依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。

典型贴壁细胞平板密度

培养板大小

生长面积（cm2）

大约细胞数

培养基容积（ml）

组织培养皿（φ60mm）

28

6．6×

105

5-6

6孔培养板（φ35mm）

9.5

1-2

12孔培养板φ22.6mm）

4

1．3×

0．5-1

24孔培养板（φ8mm）

0．5

0．6×

0．25-0．5

3、 

SHG-44细胞的转染：

（1） 

转染当天，加入脂质体/DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。

（2） 

准备不同比例的DOSPER/DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。

①溶液A：

用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg到总体积50μl（30μg/ml）。

②溶液B：

用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。

③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。

（3） 

不要移去培养基，逐滴加入100μl脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。

（4） 

37℃孵育6hr。

（5） 

6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。

（6） 

转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。

4、 

G418筛选：

在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。

（一）筛选结果鉴定：

（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因

（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。

（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响

①流式细胞仪分析：

SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。

②细胞生长曲线测定：

SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×

104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。

③软琼脂克隆形成率分析：

SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。

三、注意事项

1、 

优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。

用于转染的核酸应高度纯化。

为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。

但是，脂质体以及脂质体/DNA混合物无需滤过除菌。

2、 

预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。

但是在随后的脂质体/DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。

在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。

脂质体/DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。

常见问题和解答：

Q：

我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。

A：

也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好.因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?

请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选？

我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。

即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。

我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。

不知这种观点对不对。

然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？

维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？

1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ng/ml等１2个级别,培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

２。

我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。

３。

即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。

请问：

能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？

操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。

必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。

现在很多代了，很稳定。

Q：

1。

我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少