引物序列验证Word文件下载.docx
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3.点击“BLAST!
”,新页面完全出来以后,点击“Format!
”。
4.结果完全出来后,查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因,其他的就不用考虑了。
当然,如果下游引物序列所对应的基因片段的3'
端正好和上游引物序列的3'
端的1或2个碱基互补,那就可能是19-37或18-37。
如果有,那你的引物序列就是正确的。
从文献上查的引物,除了要用Blast验证其序列是否正确外,还是应该用软件分析分析到底引物好不好。
实例
1、进入网页:
http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
2、点击Searchforshort,nearlyexactmatches
3、在search栏中输入引物系列:
注:
文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
(1)输入方法可先输入上游引物,进行blast程序,同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐,而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列,还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
(2)简便的做法是同时输入上下游引物:
有以下两种方法。
输入上下游引物系列都从5’——3’。
A、输入上游引物空格输入下游引物
B、输入上游引物回车输入下游引物
4、在optionsforadvancedblasting中:
selectfrom栏通过菜单选择Homosapiens【ORGN】
Expect后面的数字改为10
5、在format中:
Expect后面的数字填上010
6、点击网页中最下面的“BLAST!
”
7、出现新的网页,点击Format!
8、等待若干秒之后,出现resultsofBLAST的网页。
该网页用三种形式来显示blast的结果。
(1)图形格式:
图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40~50分
图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40~50分,而与下游引物不互补
图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分,而与上游引物不匹配
通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。
(2)结果信息概要:
从左到右分别为:
A、数据库系列的身份证:
点击之后可以获得该序列的信息
B、系列的简单描述
C、高比值片段对(high-scoringsegmentpairs,HSP)的字符得分。
按照得分的高低由大到小排列。
得分的计算公式=匹配的碱基×
2+0.1。
举例:
如果有20个碱基匹配,则其得分为40.1。
D、E值:
代表被比对的两个序列不相关的可能性。
【TheEvaluedecreasesexponentiallyastheScore(S)thatisassignedtoamatchbetweentwosequencesincreases】。
E值最低的最有意义,也就是说序列的相似性最大。
设定的E值是我们限定的上限,E值太高的就不显示了
E、最后一栏有的有UEG的字样,其中:
U代表:
Unigene数据库
E代表:
GEOprofiles数据库
G代表:
Gene数据库
(3)结果详细信息:
①圈出来的部分代表序列的信息
②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况:
共有21个碱基匹配,得分42.1分【21×
2+0.1=42.1】,E值为0.020
上游引物与序列的2143~2163位点匹配
③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况:
共有20个碱基匹配,得分40.1分【20×
2+0.1=40.1】,E值为0.077。
下游引物与该序列的29360~29379位点互补
注意点:
①上游引物为20个碱基,为什么会变成21个碱基呢?
这是因为下游引物的第一个碱基为T,刚好与系列的2163位点的T匹配,因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。
同理,上游引物的最后一个碱基为G,被当成了下游引物了。
通过寻找有没有与1~20位点、20~40位点完全匹配的序列,就可以避免这个因素的干扰了。
②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?
A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段
B、为该基因的DNA系列
C、为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。
结果判断:
①验证文献报道的引物是否正确:
如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因,一般说明你的引物正确性没问题。
如果你blast后没有发现你的目的基因,或者分值很低,该引物就可能不适合用
②检测该引物是否存有同源序列相匹配,造成PCR反应的非特异扩增。
如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因,并且分数非常高。
这种结果表明所设计的引物序列特异性不高,最好重新设计引物,否则会得到非特异扩增的PCR产物。
如何验证设计引物序列是否合适?
zz合集
(2012-08-1011:
09:
38)
转载▼
标签:
杂谈
1.检验引物的特异性
Primer-BLAST,在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物。
Primer-BLAST可以直接从Blast主页(http:
//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)找到,或是直接用下面的链接进入:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
这个工具整合了目前流行的Primer3软件,再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。
Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤,设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。
并且,Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–animportantfeatureforPCRprotocolsmeasuringtissuespecificexpression(注:
没办法准确的翻译,只好作罢,汗!
)。
Primer-BLAST有许多改进的功能,这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。
Primer-BLAST的输入
Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。
提交的界面主要包括三个部分:
targettemplate(模板区),theprimers(引物区),和specificitycheck(特异性验证区)。
跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。
模板(Template)
在“PCRTemplate”下面的文本框,输入目标模板的序列,FASTA格式或直接用AccessionNumber。
如果你在这里输入了序列,是用于引物的设计。
Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物,并且在目标数据库(在specificitycheck区选择)是唯一的。
引物(Primers)
如果你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏。
可以在PrimerParameters区填入你的一条或一对引物。
并且选择好验证的目标数据库(在specificitycheck区选择)。
根据需要可设置产物的大小,Tm值等。
特异性(Specificity)
在specificitycheck区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。
这一步是比较重要的。
这里提供了4种数据库:
RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。
前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。
特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。
selectedreferenceassemblies包括以下的物种:
human,chimpanzee,mouse,rat,cow,dog,chicken,zebrafish,fruitfly,honeybee,Arabidopsis,和rice。
Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。
2.验证引物自身的特性
建议oligo6和primer5结合使用
在primer5.0里面,把你的基因序列粘上,在弹出窗口上选primer,点左上s是选正义,点editprimer,把你的正义引物序列粘上,点primer,就能找到你的引物在整个序列上的位置,如上再点a找反义的位置,找好后弹出窗口中rating代表评分,下面的几栏,分别是发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体,found如为红色就是有这些东西,你看一下严不严重,尤其不能出现在3'
端,△G的绝对值越小越好。
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- 引物 序列 验证
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