生化综合性试验报告.docx
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生化综合性试验报告
本科学生综合性实验报告
学号084120004姓名
学院生命科学学院专业、班级08生科A
实验课程名称生物化学综合实验
教师及职称
开课学期2009至2010学年第一学期
填报时间2009年12月21日
云南师范大学教务处编印
实验序号
实验名称
酵母RNA的提纯及其定性鉴定与定量测定
实验时间
实验室
1.实验目的:
1.1.学习生物大分子物质和提纯的基本原理、主要方法及步骤。
1.2.了解RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。
1.3.掌握两种定量测定和定性鉴定所得RNA的原理和方法。
14.学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。
1.5.学习离心技术在生物实验中的应用。
2.实验流程、实验原理:
2.1.实验流程:
酵母RNA的提纯。
RNA的定性鉴定及其定量测量。
2.2.实验原理:
Ⅰ、提纯RNA的基本原理:
细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。
因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。
RNA提制过程是:
①使RNA从细胞中释放,将它与蛋白质分离,然后将菌体除去;②根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将PH制调到2.0~2.5,使RNA沉淀,进行离心收集。
Ⅱ、定性鉴定的基本原理:
一、RNA基团鉴定:
RNA含有核糖,嘌呤、嘧啶碱和磷酸组分,叫硫酸煮沸可使其水解,用地衣酚,硝酸银以及定磷试剂可产生沉淀或者颜色反应以分别鉴定出核糖,嘌呤碱以及磷酸。
1、核糖基团鉴定:
2、磷酸基团鉴定:
一.实验设计方案
3、嘌呤碱基团鉴定:
4.核糖、磷酸、嘌呤碱基团鉴定反应:
①核糖与浓盐酸共热后降解糖醛与地衣酚反应鲜绿色复合物
②RNA与硫酸共热,水解嘌呤碱硝酸银嘌呤银化物(白色或红棕色)
③RNA与硫酸共热,水解磷酸钼酸铵试剂磷钼酸铵沉淀(黄色)
二、电泳分离鉴定:
任何物质质点,由于其本身在溶液中的解离或是由于其表面对其他带电质点的吸附,会在电场中向一定的电极移动。
一般来说,在碱性溶液中,分子带负电荷,在电场中向正极方向移动,而在酸性溶液中,分子带正电荷,在电场中向负极方向移动。
电泳分为自由界电泳和区带电泳(现阶段主要的电泳方法),区别在于有无支持物。
本实验选取的是用醋酸纤维素薄膜做支持物的电泳方法——醋酸纤维素电泳。
Ⅲ、定量测定的基本原理:
一、地衣酚法定量测定:
当RNA与浓盐酸供热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与地衣酚反应,在三价铁离子和二价铜离子的催化下,生成鲜绿色复合物。
反应产物在670nm处有最大吸收。
RNA浓度在20~250ug/ml范围内,光密度与RNA浓度成正比。
二、紫外吸收法定量测定:
核酸分子中嘌呤环和嘧啶环的共轭双键所具有的吸收紫外光线的性质。
3.实验设备及材料:
3.1.实验设备:
电子天平,锥形瓶,玻璃棒,电热套,离心机,0.5~5.0精密PH试纸,烧杯,滴管,抽滤瓶,离心管,恒温水浴箱,吸量管,紫外分光光度计,表面皿,量筒,容量瓶,擦镜纸,比色皿,定量滤纸,试管,布氏漏斗,真空泵,电泳仪,紫外检测仪,可见光分光光度计,托盘天平,电泳槽。
3.2.实验材料:
干酵母粉,RNA标准溶液,5%硝酸银溶液,钼酸铵试剂,地衣酚试剂,Nacl,95%乙醇,6mol/lHcl,高氯酸,柠檬酸缓冲液。
4.实验方法步骤及注意事项:
4.1.实验方法步骤:
Ⅰ、RNA提纯(浓盐法):
①取12g活性干酵母置250ml锥形瓶中,加60ml蒸馏水,混匀。
②倒入7gNacl,溶解后,沸水浴50min~1h,取出,冷却,倒入8支离心管中,平衡。
③3500rpm离心8min,将上清液倒入50ml烧杯中,一边冰水浴(10min)一边调节PH,至2.0~2.5。
④将杯中物质(含沉淀)移入4支离心管中,3500rpm离心8min,弃上清液,将沉淀移入10ml烧杯中,95%乙醇5~10ml洗涤。
⑤用布氏漏斗真空抽滤。
⑥干燥,称重,计算提取率(并保存好RNA)。
Ⅱ、定性鉴定:
一、RNA组分基团鉴定:
取适量0.05g提取的RNA,加10%硫酸液3ml,放在沸水浴中加热10min,制成RNA水解,做以下的鉴定:
●嘌呤碱基的鉴定:
取水解液0.5ml,加氨水0.5ml及5%硝酸银溶液0.3ml,观察是否产生絮状嘌呤银化物(有时絮状物出现较慢,需放置十几分钟)。
●磷酸的鉴定:
取水解液0.5ml,加2滴浓硝酸酸化,再加入0.5ml钼酸铵试剂,放在沸水浴中加热10min,冷去静置后观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀产生。
●核糖的鉴定:
取水解液0.5ml,加地衣酚0.5ml,放在沸水浴中加热2min,观察颜色的变化。
二、醋酸纤维素电泳分离鉴定:
1、RNA的碱水解:
称取0.1gRNA,溶于5ml0.3mol/L氢氧化钾溶液中,使RNA的浓度达到20~30mg/ml。
沸水浴30min。
将水解液转移到锥形瓶中。
冰浴中用高氯酸溶液滴定到水解液PH3.5。
2000r/min离心10min,除去沉淀,上清液即是样品液。
2、准备与点样:
(1)、将薄膜切成2.5cm×8cm的小片,在薄膜无光泽(正面)的一端约2cm处用硬铅笔划一点样线。
(2)、将薄膜无光泽面向下,置PH3.5,0.02mol/L的柠檬酸缓冲液浸湿。
(3)、用镊子将充分浸透的膜条取出,用滤纸吸去多余的缓冲液,将盖玻片折成不均匀的两半,用最短边<边长<最长边在距膜条一端2—3cm处点样。
3、电泳:
将点样后的膜条置于电泳槽架上,放置时,无光泽面向下,点样端置于负极,槽架上以双层滤纸作为垫桥,滤纸的两端与支架的两沿对齐,膜条与滤纸需要贴紧,展评。
待平衡5min后通电,电压为160V,电流为0.4—0.7mA/cm,通电25min左右关闭电源。
4、记录结果:
通电完毕后用镊子将薄膜取出,与紫外灯下观察,用铅笔将吸收紫外灯的暗斑圈出,并分析确定各个斑点代表哪种核苷酸。
Ⅲ、定量测定:
一、地衣酚法定量测定:
1、标准曲线的制作:
取6支试管,按照下表编号及加入试剂,加完后,混匀,置沸水浴中加热45min。
取出冷却,于670nm波长处测定光密度值。
管号试剂
0
1
2
3
4
5
标准RNA溶液(ml)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水(ml)
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
地衣酚试剂(ml)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2、样品的测定:
准确称取少量的酵母RNA(0.1或0.2g)。
放入小烧杯中,加少量蒸馏水调成糊状,溶解,若不溶解,用Hcl,然后调至PH7.0,小心转移到25ml容量瓶中,用蒸馏水定溶到刻度,混匀。
取0.625ml样品液,稀释到40ml后,分别取2份2.0ml的稀释液,加入2.0ml的地衣酚试剂,混匀,与标准曲线的各管同时置沸水浴中加热45min,冷却,测定在670nm波长处的光密度值。
3、RNA含量的计算:
根据测得O.D值,从标准曲线上查出相对应的RNA含量,按下式计算制品中RNA的百分含量。
RNA%=〔待测液中测的的浓度(ug/ml)/待测液中制品的浓度(ug/ml)〕×100
二、紫外吸收法定量测定:
1、用分析天平准确称取待测的样品RNA0.150~0.200g,加入少量的蒸馏水调成糊状,再加入少量的水稀释。
用5%—6%的氨水调至PH7.0,定容到10ml。
2、取两支离心管,向第一支管中加入1ml样品溶液和1ml蒸馏水。
向第二支管中加入1ml样品溶液和1ml沉淀剂,混匀。
3、在冰浴中放置30min,然后离心10min,3000r/min。
4、从各管中取出0.25ml上清液,用蒸馏水定容到25ml。
5、于260ml处测定其光吸收值(OD1、D2)。
计算核酸浓度:
(OD1—OD2)
RMA%=0.022×100
样品浓度
6、当OD260/OD280≈2.0,所提取样品纯度很高。
4.2.实验注意事项:
1、RNA浓盐法提纯时,沸水浴后需冷却后将样液转移到离心管内。
离心前一定要将对应位置的离心管进行平衡。
离心机使用时要待转速归为零时打开试室盖。
调至PH值到2.0~2.5时,边冰水浴边用玻璃棒进行搅拌,且每滴一滴盐酸都要进行搅拌。
2、地衣酚法定性测定时,分光光度计的使用。
标准曲线制作和样品测定应在同一台仪器上进行(即使用的型号一致)。
若不连续测定光密度值,需暂时用遮挡光路的“黑体”(UV—2000型)或者打开试样室盖门关闭光门(722s型)。
比色皿的称液量以达到比色皿容积的3/4~2/3左右为宜。
每套仪器的比色皿不可随意换。
3、醋酸纤维素电泳定性测定时,常选用PH8.6巴比妥—巴比妥钠缓冲液,其浓度为0.05—0.09mol/L。
选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。
点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免引起样品扩散,但不宜太干,否则样品不易进入膜内。
点样时,动作要轻、稳、用力不能太大、以免损坏膜片。
电泳时,应该选择合适的电流强度。
4、整个实验过程中,要注意试剂的准确用量以及操作的动作标准。
5、在操作实验工程中,像沸水浴时、运用到浓硫酸等具有腐蚀性的化学试剂时一定要注意个人及他人的生命安全。
6、做实验要身穿专用实验服,待做外实验后要及时的对手部进行清洁。
5.实验数据处理方法:
①用分光光度计测量出,在670nm波长处地衣酚和核糖形成的绿色复合物,在不同浓度下的光密度值。
以不同的RNA浓度作为横坐标,相对应的光密度值OD作为纵坐标绘制标准曲线图,测出样品溶液的两个光密度值(OD1、OD2),求出平均值,通过测出的光密度值在标准曲线图上对应,则可知道样品溶液的密度,测出样液中RNA的含量。
②用电泳从RNA中分离出四种核苷酸。
在紫外灯下观察电泳结果(醋酸纤维素薄膜),用铅笔沿着四个区域的边沿画下来,以便不用紫外时可观察。
计算出每种核苷酸的运动速率,对照书上的表格找出每个区域对应的核苷酸即可。
1.实验现象与结果:
Ⅰ、定性鉴定部分:
一、RNA基团的鉴定:
1、嘌呤碱基和5%硝酸银的反应:
放置几分钟后有白色絮状沉淀产生,见过后变为棕红色絮状沉淀。
这个现象说明RNA基团中含有嘌呤碱基。
2、磷酸和定磷试剂的反应:
冷却静置后看到黄色磷钼酸铵沉淀产生。
这个现象说明RNA基团中含有磷酸。
3、核酸和地衣酚试剂的反应:
有绿色复合物生成。
这个现象说明RNA基团中含有核酸。
二、醋酸纤维素电泳分离鉴定:
待实验时间到后,取出醋酸纤维素薄膜,记住点样的位置。
打开紫外灯下,将醋酸纤维素薄膜尽量与灯管水平的放置在紫外灯下进行观察,看到大概离点样品点4cm、4.5cm、5.3cm、5.8cm处各有一端阴影,如图:
分别鉴定出:
胸腺、胞、尿、鸟核苷酸。
Ⅱ、定量测定部分:
一、地衣酚法定量测定:
1、标准曲线的绘制:
2、在相同的条件下,OD样品溶液=0.801
则样品溶液中RNA的含量≈0.8,因此求得:
待测液中测得的浓度(ug/ml)0.8
RNA%=×100=×100=89
待测液中制品的浓度(ug/ml)0.8988
二.实验报告
二、紫外吸收法定量测定:
根据公式所得:
RNA=0.594nm/0.330nm=1.8
所以所得样品纯度较高。
2.对实验现象、实验结果的分析及其结论:
本次实验我们采用的浓盐法从干酵母RNA中
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- 生化 综合性 试验报告