医学分子生物名解大题汇总Word下载.docx
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病原体基因诊断的主要技术方法实时荧光定量PCR,在临床上最大用途用于检测难以培养的病原体,检测耐药基因突变,血液筛查等。
在临床上应用如,乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒
3.基因诊断在法医学中的应用:
法医学基因诊断的分子基础是基于人类基因组结构中存在一些可作为个体特征标示(遗传标志)的序列,即可变串联重复序列(小卫星DNA)的多态性。
常用遗传标记有1)RFLP:
限制性片段长度多态性2)重复序列多态性:
如可变串联重复序列3)单核苷酸多态性(SNP):
DNA序列的单个核苷酸的差别。
最常用于个人识别和亲子鉴定。
2、举例说明基因治疗的主要程序
包括基因表达的检测、治疗效果的体外研究、建立动物模型、治疗效果的体内研究、药代及药理毒理研究、中试研究、申报及进行临床试验、扩大规模进行试生产。
目的基因的选择:
你感兴趣的任何与疾病相关的基因,如能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因,能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因,肿瘤药物增敏基因如,单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSK-TK)基因。
目的基因的获得:
可通过基因克隆化,基因的人工合成,基因的聚合酶链反应以及人类基因组降解等方法,因为基因治疗中应用的目的基因都是导入体细胞,故目的基因可以是染色体基因组也可以是互补DNA。
载体的选择:
有病毒载体和非病毒体两类,病毒载体介导的基因转移效率较高,因此它也是使用最多的基因治疗载体。
如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。
选择基因治疗的靶细胞:
体细胞:
目前基因治疗的现状仅限于体细胞。
基因型的改变只限于患者本人,不会遗传到下代。
生殖细胞:
理论上这是基因治疗的重点,对生殖细胞中缺陷基因的纠正,不仅使患者本人(当代)的缺陷得以更正,而且能将正常基因遗传到下代,是一种彻底根治缺陷的方法。
但是由于风险大,问题复杂。
基因转移:
应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源目的基因(可以是基因的DNA片段或序列)转移到受体菌或者细胞内,并在细菌或细胞内实现转入基因的扩增和表达,称为基因转移技术。
将重组的目的基因载体高效转入特定靶细胞,常用1、非病毒导入法:
直接注射法、电穿孔法、脂质体法、阳离子多聚体等;
2、病毒载体导入法:
重组病毒载体如反转录病毒,腺病毒等。
基因表达的检测:
应用分子生物学技术检测基因表达,常用技术有RT-PCR,real-timePCR,northernblot,southernblot,westernblot等
举例:
1990.9.14首例基因治疗4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)导致2--脱氧腺苷含量升高其毒性严重破坏免疫功能。
目的基因是ADA基因,载体是逆转录病毒载体,靶细胞为病人淋巴细胞,回输。
完成基因治疗。
肿瘤相关基因
病毒癌基因:
存在于病毒基因组的癌基因称为病毒癌基因。
它不编码病毒的结构成分,对病毒的复制也没有作用,但其异常表达可以使宿主细胞持续增殖,产生肿瘤或使培养细胞转化成癌细胞的动物病毒基因。
如src基因与RSV诱发肿瘤有关。
抑癌基因:
一类抑制细胞过度生长、增殖,从而遏制肿瘤形成,当缺失或变异抑癌功能丧失导致肿瘤生成的基因。
也称为肿瘤抑制基因或隐性癌基因。
具有调节细胞增长,抑制细胞增殖,诱导终末分化和细胞凋亡,维持基因稳定,改变DNA甲基化酶活性,调解组织蛋白酶活性等功能。
常见有p53、Rb基因等。
试述原癌基因的激活机理
常见的激活因素是病毒,化学物质和辐射。
癌基因的激活机理有:
1、点突变:
原癌基因在射线或化学致癌剂作用下,可能发生单个碱基的替换导致点突变,从而改变了表达蛋白的氨基酸组成,造成蛋白质的结构异常。
比如,ras癌基因的点突变影响自身GTP酶活性。
2、启动子插入:
插入具有高活性的启动子或增强子,使原癌基因持久、过量地表达。
逆转录病毒的LTR含较强的启动子和增强子,鸡淋巴细胞瘤由于白细胞增生病毒(ALV)的LTR插入c-myc的旁侧(5′或3′端),使c-myc的表达比正常高30-100倍。
3、基因扩增:
基因拷贝数的增加称为基因扩增。
原癌基因扩增使转录模板增加,mRNA的水平增高,表达活性增加,产生过量的表达蛋白而导致肿瘤的发生。
比如,小细胞肺癌的L-myc的扩增。
4、染色体异位:
原癌基因在肿瘤细胞中从染色体正常位置转移到其他某个位置上称为染色体易位。
A、易位导致原来无活性的原癌基因移至启动子或增强子附近而激活。
B、易位后失去原旁侧的抑制性调节作用,使其表达增强。
比如,c-myc易位到人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因位点的高活性转录区,使c-myc激活。
不同的癌基因有不同的激活方式,一种癌基因也可有几种激活方式。
细胞转化实验证明,各种癌基因之间存在协同作用,肿瘤的发生是多步骤,多因素的,不同的癌基因作用于肿瘤发生的不同阶段。
基因组学和蛋白质组学
基因组(genome):
泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质,包括基因和基因间区域。
包括:
原核生物基因组、真核生物基因组、病毒基因组。
(细菌染色体dna;
质粒dna存在细菌染色体外的具有自主复制能力的环状双链dna分子),真核生物基因组(每条染色体多个复制起点,基因不连续性,转录产物是单顺反子,大量重复序列,ps、人类线粒体基因组2个rRNA基因和tRNA基因,13个编码蛋白质基因,编码序列占93%,有许多拷贝),病毒生物基因组(基因组较小,有的是DNA有的是RNA,可以在一个启动子的作用下,形成多顺反子mRNA)
基因组学(genomics):
是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支,主要研究生物体全基因组的分子特征。
就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序,分析生命体(包括人类)全部基因组机构和功能。
包括结构基因组学,功能基因组学,比较基因组学。
结构基因组学:
概念:
以全基因组为研究对象,进行基因作图,序列分析,基因鉴定。
主要目的:
建立高分辨的遗传、物理、转录和DNA序列等图谱。
人类基因组计划就是测定人类基因组全序列,属于结构基因组学的研究。
功能基因组学:
认识分析整个基因组所包含的基因,非基因序列及其功能。
比较基因组学:
比较不同物种的整个基因组,增强对各个基因组功能及发育相关性的认识。
1.结构基因组学的研究内容
基因组图谱的构建:
在进行大规模序列测定之前,首先要构建基因组图谱,以便从粗到细的分析基因,锚定测知的核酸序列在染色体中位置。
1、遗传图谱:
是利用人类基因组中的一些特殊位点作为遗传标志而进行的基因组分区。
即通过计算遗传标记的重组率,以重组率的大小反映遗传标志间的相对距离绘制遗传图谱(1厘摩表示重组率为1%)这些技术是以遗传连锁为基础所以称为连锁图谱。
遗传图谱的构建:
基因定位:
根据重组值确定不同基因在染色体上的相对位置和排列顺序
图距:
两个位点在染色体上位置单位:
厘摩cM
遗传标记,在基因组中具有遗传多态性的位点,每种等位基因出现频率大于1%
RFLP,SSLP(VNTR,STR),SNP
2、物理图谱:
利用已知序列的DNA片段为基因组分区,位点距离用bp表示,可用标记片段的部分酶解法。
3、转录图谱:
转录体或其反转录而成的cDNA在基因组中的位置,又称基因图谱或表达图谱;
是根据组织细胞中可表达片段标签绘制的图谱。
是将mRNA逆转录合成的cDNA或EST的部分cDNA片段作为“探针”与基因组DNA进行分子杂交,标记转录基因,绘制出可表达基因的转录图。
4、序列图谱:
是人类基因组的全部核苷酸的排列顺序。
将人类基因组DNA分段克隆,然后逐段进行序列分析,在按标志将各重叠片段拼接,构成完整的基因组DNA序列图。
蛋白质组:
是指一个基因组、一种生物、一种细胞或组织所表达的全套蛋白质
蛋白质组学:
是在整体水平上研究细胞内蛋白质及其活动规律的科学。
它采用大规模、高通量、高灵敏度的技术手段,通过全局性研究基因组所表达的所有蛋白质在不同时间与空间的表达谱和功能谱,全景式的揭示生命活动的本质。
1.主要技术路线:
包括:
样品选择和处理,蛋白质分离,蛋白质的识别和鉴定
样品处理的基本原则:
1.尽可能采用简单的方法进行处理,以免蛋白丢失.
2.细胞和组织样品的制备尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解.
3.样品裂解液应该新鲜制备,已制备好的样品不要反复冻溶,保存在-80℃.
4.加入尿素之后加温要小于37℃,因为加热后尿素分解产生的异氰酸盐可对蛋白质产生氨基甲酰化修饰,引起电荷改变.
可溶性样品(血清血浆尿样脑脊液等):
蛋白浓度较高的样品可稀释后分析;
高丰度蛋白质会干扰表达量少的蛋白质,应除去后电泳;
低浓度蛋白或高盐样品,可透析或液相色谱浓缩或脱盐等方法。
组织样品(正常组织或肿瘤组织):
正常组织或肿瘤组织。
不同细胞的分离方法:
免疫亲和技术,激光捕获显微切割技术(LCM)
细胞样品:
悬浮培养生长的细胞理想方法是通过离心收集,随后用磷酸缓冲液清洗并保存在缓冲液中。
固体培养基中培养的细胞刮擦的方法避免使用蛋白裂解液。
2.三大基本支撑技术:
1、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术2-DE
又称双向电泳,原理是根据蛋白质的两个一级属性:
等电点和分子量的特异性,将蛋白质混合物在电荷和分子量两个水平上进行分离。
一向:
等电聚焦电泳。
原理:
在聚丙烯酰胺凝胶中加入两性电解质,使其在电场中形成一个连续且稳定的线性或非线性的PH梯度,使PH从凝胶的正极向负极依次递增,电泳时被分离的蛋白质在偏离等电点的PH位置时,因带有电荷而移动,到达等电点区域时便不再移动,因此可根据等电点不同使蛋白质得到彼此分离。
固相ph梯度(IPG胶条)对新样品常使用宽范围IPG梯度胶条,再使用窄范围IPG胶可以加大上样量观察更多蛋白质点。
二向:
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理:
当在凝胶加入一定量的SDS,就构成了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。
SDS使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS复合物,使蛋白质在水中的形状呈椭圆形,只是大小不同;
由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质的SDS复合物都带有几乎相同密度的负电荷,大大超过了蛋白质分子原有所带的负电荷,因而掩盖了不同蛋白质电荷之间的差别。
这样蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而是取决于蛋白质分子量的大小。
2D-DIGE双向荧光差异凝胶电泳,利用荧光染料标记蛋白质,进行双向电泳。
技术优势:
1,高效性,在同一凝胶上可以电泳两个样品减轻工作量2,与常规银染相比灵敏度高3,检测动态范围更大4,定量精确,采用内标而消除了胶与胶之间的误差5统计学分析,降低操作者之间偏差
2、计算机图像分析和大规模数据处理技术
主要是依赖于计算机和数据库信息对二维凝胶电泳分离得到的图谱上的蛋白质进行定位,定量,图谱比较,差异点寻找等。
图像采集→斑点检测→背景消减→蛋白质在图谱上定位→蛋白质计数→蛋白质差异表达的检测(上调,下降或出现,消失)
3、生物质谱技术
生物质谱技术是把生物大分子离子化后,根据不同离子间的质荷比(M/Z)的差异来分离并确定相对分子质量的一类技术。
电离方法:
电喷雾电离质谱;
基质辅助激光解吸电离(MALDI)。
肽指纹图谱的原理:
将蛋白质经酶切之后,形成长短不一的肽段,通过质谱仪检测就可得到所有肽段的分子量,从而形成不同质量的肽段质量图,就是肽指纹图谱(peptidemassfingerprinting,PMF)对于相同的蛋白质来说,PMF应该是一定的,因此可特异的检测样品中的未知蛋白质.
肽序列标签技术:
根据部分氨基酸序列,结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子的质量,在数据库中查寻的鉴定方法称为肽序列标签(peptidesequencetag,PST)技术。
蛋白质空间结构的测定
二级结构测定,通常采用圆二色光谱测定
三级结构测定,X射线衍射法;
核磁共振技术
蛋白质组学研究目前存在的问题2-DE方法存在的问题(瓶颈)
1)低丰度蛋白质点的检测
2)极酸和极碱性区的蛋白质分离
3)高分子质量蛋白质的分离
4)膜蛋白的提取和有效分离
多维色谱在蛋白质组学的应用:
常见方法有多维高效液相色谱(HPLC);
多维毛细管电泳(CE);
多维高效液相色谱毛细管电泳(HPLC-CE)
细胞信号传递
胞信号传递的概念:
信息物质(分子)通过一系列中间环节把信号传递到靶细胞内,使靶细胞产生生物学效应。
受体概念:
受体(Receptor)是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合,进而引起生物学效应的特殊蛋白质。
配体概念:
配体(Ligand)是能与受体特异结合的生物活性分子,如:
细胞间信号分子、药物、维生素、毒物。
1、胞信号传递基本过程:
特定细胞合成并分泌信号分子→信号分子通过扩散或血循环到达靶细胞→靶细胞的受体识别并结合信号→反应将信号传递到靶细胞内→生物学效应。
2、受体的分类:
(1)膜受体(Cellmembranereceptors):
配体门控离子通道;
G蛋白联受体;
单个跨膜
α螺旋受体
(2)胞内受体(Intracellularreceptors):
胞质受体(Cytosolicreceptors)、核受体
(Nuclearreceptors)
3、受体作用的特点:
(1)高特异性(Highspecificity):
受体只能和其分子构象互补的特定配体结合
(2)高亲和力(Highaffinity):
酶-底物:
Km(10-5~10-9mol/L);
L-R:
Kd(10-9~10-12mol/L
(3)可饱和性(Saturability):
受体数目有限→受体结合配体的能力有限
(4)可逆性(Reversibility)
(5)可调节性:
受体的数目Ch↑→LDL受体数目↓;
受体和配体的亲和力;
上调和下调
4、G蛋白的结构特点:
G蛋白是鸟苷酸结合蛋白(guaninenucleotidebindingprotein)的简称。
特点:
与GDP/GTP可逆结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白、属于GTPase超家族。
G蛋白是杂三聚体:
由αβγ亚基组成的杂三聚体蛋白,各种G蛋白α亚基分子彼此结构虽有不同,但都含有GTP或GDP结合位点及受体结合位点,并具有GTP酶活性,可是GTP水解为GDP。
当α亚基(活性亚基)与GDP结合时,α与βγ结合成αβγ三聚体,α亚基没有GTP酶活性;
当α亚基与GTP结合时,则α与βγ解离,α亚基具有GTP酶活性并具有调节效应蛋白的活性。
β:
7个β-sheet;
γ:
2个α-helix。
通过共价结合脂肪酸锚定在膜上。
5、G蛋白作用机制:
当受体未与配体结合时,G蛋白以无活性的αβγ三聚体形式存在并与GDP结合,当激素H与受体R结合,则活化的受体与α亚基结合,使GDP从α亚基解离,而与GTP结合,GTP结合于α亚基后,G蛋白α亚基便与βγ亚基解离,然后α亚基再与受体分离;
游离的α亚基—GTP复合物则作用于效应器E1(酶)调节其活性或βγ亚基作用于另一个效应器E2,α亚基使GTP水解生成GDP和Pi,无活性α亚基又与GDP结合,再与βγ亚基结合生成Gαβγ·
GDP受体作用也就终止。
6、G蛋白种类:
G蛋白根据α亚基分类,分为Gs—激活腺苷酸环化酶即AC↑;
Gi—AC↓PLC↑PLA2↑;
Gq—PLC↑;
Gt—激活cGDP磷酸二酯酶
7、几条信号通路比较:
cAMP-PKA
Ca2+-PKC
Ras-MAPK
胞内受体
L
激素(促甲状腺素,催乳素等),蛋白质(促甲状腺素,生长激素等),多肽类(降钙素,抗利尿激素等),儿茶酚胺类(肾上腺素)
乙酰胆碱,组胺,肾上腺素,缓激肽等
表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等
类固醇激素、甲状腺激素
R
GPCRs(G蛋白偶联受体)
GPCRs(-Gq)
TPKs
受体和配体结合引起受体酪氨酸激酶活化,受体二聚化以及自身磷酸化
胞质受体、核受体(类固醇激素受体,糖皮质激素受体等)
效应酶
腺苷酸环化酶AC
PLCβ
第二信使
cAMP
IP3、DAG、Ca2+
靶蛋白
PKA(调节代谢的关键酶/调节转录的蛋白因子)
PKC(膜受体,膜蛋白,多种酶)
膜受体,多种酶
生物学效应
转录水平调控,激活的PKA可使转录因子磷酸化。
PKA的C亚基可进入细胞核,使CREB磷酸化(细胞核存在cAMP反应元件即CRE,与CRE结合的蛋白称为CREB),调节基因表达;
参与细胞生长发育和物质代谢等。
PKC作用是磷酸化下游靶蛋白ser/thr残基,改变靶蛋白活性,从而调节细胞物质代谢和基因表达。
参与细胞增殖与分化分泌,物质代谢以及调控转录基因表达等
发挥转录调节作用,影响细胞分化等长期的生物学效应
举例
肾上腺素调节糖原调节→可使磷酸化酶b激酶磷酸化→激活→促进糖原分解
糖原合成酶磷酸化→抑制→抑制糖原合成
PKC磷酸化肌浆网的Ca2+-ATP酶→Ca2+进入肌浆网→胞浆内[Ca2+]↓
PKC磷酸化质膜的Ca2+通道→Ca2+内流→胞浆内[Ca2+]↑
当生长因子EGF与相应受体结合时,受体即二聚化,并自身磷酸化,按上述过程激活相应蛋白激酶,产生生物效应
cAMP-PKA途径:
L:
R:
效应酶:
AC
第二信使:
cAMP
靶蛋白:
调节代谢的关键酶/调节转录的蛋白因子
过程
AC
受体与配体结合→Gs+GTP→AC激活→ATP—Mg2+cAMP即激活cAMP→激活PKAPi
PKA磷酸化下游靶蛋白Ser/Thr残基→靶蛋白功能性质改变→生物学效应
生物学效应:
举例如:
PKA概念:
蛋白激酶A又称cAMP依赖性蛋白激酶,是变构酶,R2C2四聚体,C为催化亚基,R为调节亚基,R2C2解聚生成R-(cAMP)2和游离C起催化作用,PKA作用是磷酸化下游靶蛋白ser/thr残基,改变靶蛋白活性,从而调节细胞物质代谢和基因表达
Ca2+-PKC途径:
GPCRs
效应酶:
PLC
第二信使:
IP3,DAG,Ca2+
膜受体,膜蛋白,多种酶
过程:
胞外信息分子与G蛋白偶联受体结合使G蛋白αq,α11,α15,α16活化→PI—PLC活化→PIP2→IP3+DAG
IP3与IP3受体结合,IP3受体是内质网膜上的配体门控Ca离子通道,IP3和IP3受体结合使钙离子通道开放,内质网中Ca2+释放到胞质中→胞质中Ca2+↑,Ca2+促进PKC结合膜脂(PS)而被激活,PKC与PS,DAG,Ca2+形成复合物而活化。
生物学效应PKC作用是磷酸化下游靶蛋白ser/thr残基,改变靶蛋白活性,从而调节细胞物质代谢和基因表达。
PKC调节基因表达:
早期反应:
磷酸化立早基因的反式作用因子→促进立早基因的表达→早期反应(立早基因:
细胞原癌基因(c-fos,AP1/c-jun);
第三信使:
c-fos蛋白,AP1/c-jun蛋白)
晚期反应第三信使磷酸化→晚期反应基因活化→晚期反应
Ras-MAPK途径:
表皮生长因子,成纤维细胞生长因子,血管内皮生长因子等
R:
TPKs
生长因子→酪氨酸蛋白激酶受体→Grb2(含SH2/SH3)→Sos(GEF活性)→
GDPGTP
Ras·
GDPRas·
GTP(有活性)→Raf激活(丝/苏蛋白激酶)→MEK
Pi
其他胞质蛋白
(酪/苏蛋白激酶)激活→MAP(丝/苏蛋白激酶)激活——→其他蛋白激酶
核内蛋白转录因子
参与细胞增殖与分化分泌,物质代谢以及调控转录基因表达等
TPK酪氨酸蛋白激酶,一类催化ATP之γ—磷酸转移到蛋白质酪氨酸残基上
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