REACH法规 第四卷译稿30.docx

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REACH法规第四卷译稿30

B．30慢性毒性测试

1.测定方法

1.1.导论

参见引言的B部分。

1.2.定义

参见引言的B部分。

1.3.参考物质

无。

1.4.测试方法的原则

测试物质通常由恰当的途径被释放到几组实验动物中的主要生活区域，每周七天,每组一个浓度。

在接触于被测试物质期间和之后，应每天观察实验动物以探查中毒信号。

1.5.质量标准

无。

1.6.测试方法描述

1.6.1.准备

在实验前动物必须在实验居住和喂养条件下保持至少五天。

在测试之前，年轻而健康的动物被随机的分配到测试组和对照组中。

1.6.2.测试条件

实验的动物

优先使用的种类是老鼠。

以先前的研究结果为基础，其它的种类（啮齿目或非啮齿目）也可能被使用。

应使用通常使用的实验室品系中的年轻而健康者而且应该在断奶后尽快地之开始试剂剂量。

在研究的开始，所使用动物的体重变化不应该超过平均值的±20%。

当进行一个子慢性的口饲研究以作为一项长期的研究的准备，在两项研究中应使用相同的种/族和品系。

数量和性别

如果是啮齿目动物，则应该在每个剂量水平和相应的对照组使用至少40只动物（20只雌性和20只雄性）。

雌性应该是未生育过的和非怀孕的。

如果预期中途会有死亡，则在实验结束前应增补实验中计划使用的动物的数量。

对于非啮齿目的动物,数量要少一些，但是每一组每种性别至少四只是较合理的。

剂量水平和接触频率

除了相应的对照组以外应至少使用三个剂量水平。

最高的剂量水平应该引起明显的中毒信号而不引起过度的致命。

最低的剂量水平应不产生中毒现象。

居间的剂量应该在高浓度和低浓度之间的中间范围中建立。

剂量水平的选择应考虑先前的毒性测试和研究的数据。

接触频率通常是每天的。

如果化学药品是混在饮用水中或混在食物中被测试则它应该是可连续获锝的。

对照

应使用一个对照组，它在每一方面都与测试组完全相同，除了对被测试物质的接触程度不同。

在特殊的环境中,比如涉及喷雾剂的吸入研究或在口饲实验中使用一种不明生物学活性的乳化剂,则一个协同的阴性的对照组也应该被使用。

阴性的对照组以与测试组相同的方法被处理，除非不把动物接触于被测试物质或任何赋形剂。

给药途径

二条主要的实施途径是口饲的和吸入。

途径的选择取决于被测试物质的物理性质和化学性质，以及类似的人类的作用途径。

使用皮肤这条途径将提出值得考虑的实际问题。

经皮肤吸收产生的慢性的全身的毒性常常会需要另一个口饲测试和由先前的皮肤毒性测试所得的关于皮肤吸收程度的知识。

口饲研究

如果测试物质由胃肠道被吸收并且如果摄取途径是一种人类可适用的,则使用口饲途径是优先考虑的除非存在进禁忌征状。

动物可能由食物，溶解于饮用水或胶囊接受测试物。

理想状态下,应使用以每周七天为基础的每日剂量，因为以每周五天为基础的剂量可能会使动物在非施药期康复或使毒性衰退。

这样就影响了结果和相应的评价。

然而,主要基于实际考虑,以每周五天为基础的剂量也认为是可接受的。

吸入研究

由于吸入研究比其它实施途径提出了更为复杂的技术条件,关于这种实施模式的更详细的指导在这里给出。

它也应该注意到内呼吸道灌输可能在特定的情况下产生明显的变化。

长期的作用通常是以设计的人类实验为原型的。

或者在小室的浓度达到平衡后每天给动物作用六个小时，每周五天（间歇性的作用）,或者,与可能的环境接触相关联,每天作用22到24小时，每周七天（连续性的作用）,以及每天在相似的时间里花大约一小时来喂养动物和维持小室。

在两种情况下，动物通常接触于固定浓度的测试物下。

间歇性作用和连续性作用之间一个主要的不同是，前者有一个17到18个小时的

恢复期。

在周末，恢复期就更长了。

选择间歇性作用还是连续性作用取决于研究对象和要被模拟的人类接触。

然而，必须考虑某些技术上的困难。

比如说,连续作用法模拟环境条件的优点可能会被以下情况抵销，如在接触期间添水喂食的可能性，对较复杂的（且可靠的）喷雾剂和蒸汽的需要，发生和监控技术。

接触室

动物应该在维持空气动态流动的吸入仪器中进行测试。

它们至少每小时更新12次大气以保证充足的氧气供应和大气中接触程度的均匀分布。

对照室和作用室在结构上和设计上应完全相同以保证接触条件在所有的方面除了对被测试物的接触程度外都具可比性。

通常要保持小室里一个微小的负压以防止被测试物质渗漏到周围的环境中。

小室应该尽量降低被测试动物的拥挤度。

经验规则表明,为保证小室大气的稳定性，测试动物的总体积不应该超过测试室的体积的5%。

量度或测定应由下列部分组成:

（i）空气流动:

通过小室的空气流动的速率应被连续地测定

（ii）浓度:

在每天的作用周期中，测试物质浓度的变化不应该超过平均值的15%;

（iii）温度和湿度:

对于啮齿目动物，温度应该保持在22+-2摄氏度，湿度应在30%到70%之间,除非使用水来保持小室大气中的测试物。

最好两者都被不断地检测;

（iv）粒子尺寸的测量:

粒子-大小分配应该由小室大气中的液体或固体喷雾剂决定。

喷雾剂粒子的尺寸应该对测试动物是可呼吸的。

小室大气的样品应该从动物的呼吸区域中提取。

空气样品应应能代表动物所在处的粒子分布且应该对所有的悬浮喷雾剂在重量分析上有价值，哪怕大部分喷雾剂是不可呼吸的。

应尽可能多地进行粒子尺寸分析以保正喷雾剂的稳定性。

之后，在作用期间也要尽可能多地分析以确定动物接触于适当的粒子分布密度。

研究的持久性

实施周期应至少持续12个月。

1.6.3.实验步骤

观察

每天至少进行一次仔细的临床检查。

附加的观察要天天进行，用适当的行动来最小化研究中动物的损失，比如对被发现已死亡的动物进行尸体剖检或冷藏，对虚弱或垂死的动物进行隔离或处死。

仔细观察以探查所毒性性效应的发生与进展，同时尽可能降低由疾病，自体分解，同类相食造成的损失。

临床信号,包括所有动物的神经学上的，眼睛的变化以及死亡率都应被记录。

毒性条件产生和发展的时间，包括疑似肿瘤,都应该被记录。

在开始的13周里应每周记录所有动物个体的体重，其后的测试应至少每四个星期一次。

在研究的最初13个星期里,应每周确定食物的摄取量，之后大约每隔3个月测一次，直到健康状况或体重变化出现异常。

血液学测定

应该在三个月,六个月,和随后的大约每隔六个月一次，以及实验最后，对从所有的非啮齿目动物和所有组中抽取的每种性别10老鼠的血样进行血液学测定（例如：

血红蛋白总数，储存细胞体积,红血细胞总数,白血细胞总数，血小板数或血凝势的量度）如果可能,每次的样品应该来自相同的老鼠。

除此之外,应从非啮齿目中收集一个预测试样品。

在研究期间如果临床观察表明动物的健康在恶化,则应在受影响的动物上实施血球计数鉴别诊断。

血球计数鉴别诊断是在高剂量组和对照组的动物样品中实施的。

只有在高剂量组和对照组中存在较大差异时，或由病理学结果表明此迹象时，血球计数鉴别诊断才在较低的剂量组中实行。

尿分析

从所有的非啮齿目动物和所有组中每种性别各10只老鼠身上提取尿样，如果可能，在同样的时间间隔从同样的老鼠中收集以供血液学测定分析。

以下各项测定应在个体动物或啮齿目动物组中每一性别的集中样品中进行：

-外观:

个体的动物体积和密度,

-蛋白质，葡萄糖,酮类,occult血,（半-定量）

-沉淀物的显微放大.（半-定量）

临床化学

大约每隔六个月一次和在结尾，要从所有的非啮齿目动物和所有组中每种性别各10只老鼠身上抽取血样以供临床化学测量，如果可能,每次从相同的老鼠上抽取。

除此之外，应从非啮齿目动物中收集一个预测试样品。

从这些样品中制备血浆。

随后的测定包括:

-总蛋白质浓度,

-蛋白质浓度,

-肝功能测试（例如：

碱性磷酸酶的活动,谷氨酸丙酮酸转氨酶7活动和谷氨酸丁酮二酸转氨酶8活动）,谷氨酰转肽酶,鸟氨酸脱羧酶,

-糖代谢,比如快速的血葡萄糖,

-肾功能测试,比如血尿素氮。

完整的解剖

应该在所有的动物上实施完整的尸体剖检，包括那些在实验中死去的或因被发现将死而被杀掉的。

在死亡之前,应从所有的动物中收集血样,以供血球数差别测定。

所有可见的肉体损伤，肿瘤或疑似肿瘤的损伤都应该被保存。

应尝试使用显微镜研究以联系所有的观察。

所有的器官和组织应该被保存以供组织病理学测定。

这通常与下列各项器官和组织有关:

脑9（延髓/脑桥,小脑皮层，大脑皮层）,垂体,甲状腺（包括副甲状腺）,胸腺，肺（包括气管）,心,主动脉,唾液腺，肝脏（3），脾脏，肾脏（3），肾上腺（3），食管,胃,十二指肠，空肠，回肠，盲肠，结肠，直肠,子宫,尿膀胱,淋巴结,胰脏，生殖腺（3）,附属生殖器,雌性的乳腺，皮肤,肌肉组织,周围神经，脊髓（颈，胸,腰的）,胸骨及骨髓，大腿骨（包括关节）和眼睛。

用固定剂使肺和膀胱胀大是最理想的保护这些组织的方法;在吸入研究中扩张肺是必要的以供组织病理学研究。

在特殊的研究,比如吸入研究中,整个的呼吸器官都应被研究,包括鼻子，咽和喉。

如果实施了其他的临床测定,从这些程序获得的信息应在显微测定前可得到，因为它可能对病理学有重要的指导。

组织病理学

所有可见的变化,特别是发生在任何器官中的肿瘤和其他的受损都应该在显微镜下进行检查。

除此之外，还推荐下列各程序:

（a）对所有保存器官和组织的显微测定和在下列各处发现的所有受损的完整描述:

1.在研究期间死亡或是被杀的所有动物;

2.所有的高剂量组和对照组的动物;

（b）低剂量组中由测试物影响而表现出反常的，或可能发生反常的组织或器官应照上述方法被测定;

（c）当测试结果表明动物的通常平均寿命有大量的减少或感应效应可能会影响毒性的反应，次一级低的剂量水平应照上述方法被测定;

（d）受损产生的信息通常发生在使用过的动物品系中，在相同的实验条件下，也就是说，历史上的对照数据,对正确地评价在被测试物中所观察到的变化的重大意义是必不可少的。

2.数据

数据应总结为表格的形式,记录下每个测试组在测试的开始时的动物个体总数,表现出受损的动物个体数,受损的类型和每个受损类型的动物受损百分比。

结果应该由适当的统计学方法处理。

任何可行的统计学方法都可能被使用。

3.结果报告

3.1.测试报告

测试报告将尽可能包含下列各项信息:

–种，品系,来源,环境状况,饮食,

–测试条件,

3.1.1.实验仪器的描述:

包括设计，型号，尺寸，空气的来源，产生微粒子和喷雾剂的系统，空气调节方法，废气处理及测试室中动物的饲养方法。

测量温度,湿度和相宜的喷雾剂浓度稳定性或粒子尺寸的仪器均应被描述。

3.1.2.实验数据:

数据应列为表格的形式并表示出平均值和对可变性的描述（比如说标准偏差）而且应该包括:

（a）空气流经吸入仪器的流速;

（b）空气的温度和湿度;

（c）标定浓度（被空气的体积分开的注入吸入器的测试物质的总量）;

（d）赋形剂的的性质,如果使用的话;

（e）被测试呼吸区域的精确浓度;

（f）居间粒子的大小,（在恰当处），

-剂量水平（包括赋形剂,如果用的话）和浓度,

-不同性别和剂量下的中毒反应数据,

-无效范围,如果存在的话,

-在研究中的死亡时间或者是否动物活至实验结束,

-中毒征状或其他效应的描述,

-对每个反常信号的观察时间和它们的后继过程,

-食物和体重数据,

-眼科的研究结果,

-血液学测试方法和所有结果，

-使用临床的生物化学测试法及所有的结果（包括任何的尿分析结果）,

-尸体剖检结果,

-所有的组织病理学研究结果的详细描述,

-对需要的地方运用统计学方法进行结果处理,

-对结果的讨论,

-对结果的解释。

3.2.评价及解释

参见引言的B部分。

4.参考文献

参