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除了血红蛋白β链的N末端缬氨酸外,血红蛋白分子内其他游离氨基也参与糖基化(α链N末端缬氨酸、赖氨酸ε-氨基)。
相对于HbA1,所有β-链N末端和其他游离氨基糖基化的血红蛋白被称作总糖化血红蛋白。
除基本的成人血红蛋白AO外,在健康人里发现少量的胎儿血红蛋白HbF(2α、2γ链)和血红蛋白A2(2α、2δ链)。
缬氨酸在δ链N末端,以类似的方式糖基化,例如,通过与葡萄糖的共价键形成HbA2c。
亲和层析测定的糖化血红蛋白作为总糖化血红蛋白。
基本内容
随着糖尿病发病率的逐年攀升,糖尿病患者人群逐渐扩大,据WHO流行病学调查资料统计,按目前糖尿病的增长速率,到2025年全世界糖尿病人口将由1995年的1亿3000万达到3亿,其中发达国家将由5100万增长到7200万,增长率为42%,而在发展中国家将由8400万增长到2亿3000万,增长率达到了170%,也就预示着在发展中国家糖尿病将成为社会巨大的负担。
中国糖尿病的患病率则由1980年的1.0%上升到1994年的2.5%和1996年的3.2%(人口年龄在20~75岁之间)。
InterAsia
2003年研究结果显示,中国成人的糖尿病患病率为5.5%,35~74岁的成年人中,男性的患病率为5.2%(约有1270万);
女性的患病率为5.8%(约1330万)。
如按总人口计算,2000~2001年中国共有约3000万糖尿病患者,但是被诊断的只占23.6%(710万)。
目前我国糖尿病患者约4500多万,其中绝大部分为2型糖尿病。
由于生活方式的不同,城乡患病率差别很大,城市人口2型糖尿病患病率平均为4.8%,但并发症控制率不足20%,已确诊的因糖尿病导致的高血压患者有1200万、脑卒中患者500万、冠心病患者600万、尿毒症患者50万。
专家指出,血糖控制不达标是造成这一现象的重要原因,而糖化血红蛋白是衡量血糖控制水平的重要指标。
糖化血红蛋白和血糖有何差别?
血糖是从食物中的碳水化合物分解而来的血液中的单糖,通常仅指葡萄糖。
血糖测试结果反映的是即刻的血糖水平。
糖化血红蛋白是糖尿病监测的“金标准”
随着人们对糖尿病知识的逐步了解,多数人已意识到空腹和餐后2小时血糖监测的重要性,并常常把二者的测定值作为控制血糖的标准。
其实不然,空腹和餐后2小时血糖是诊断糖尿病的标准,而衡量糖尿病控制水平的标准是糖化血红蛋白。
空腹血糖和餐后血糖是反映某一具体时间的血糖水平,容易受到进食和糖代谢等相关因素的影响。
糖化血红蛋白可以稳定可靠地反映出检测前120天内的平均血糖水平,且受抽血时间,是否空腹,是否使用胰岛素等因素干扰不大。
因此,国际糖尿病联盟推出了新版的亚太糖尿病防治指南,明确规定糖化血红蛋白是国际公认的糖尿病监控“金标准”。
如果空腹血糖或餐后血糖控制不好,糖化血红蛋白就不可能达标。
与血糖区别
血糖是从食物中的碳水化合物分解而来的血液中的单糖,通常仅指葡萄糖。
糖化血红蛋白是糖尿病诊断新标准和治疗监测的“金标准” 随着人们对糖尿病知识的逐步了解,多数人已意识到空腹和餐后2小时血糖监测的重要性,并常常把二者的测定值作为控制血糖的标准。
空腹血糖和餐后血糖是反映某一具体时间的血糖水平,容易受到进食和糖代谢等相关因素的影响。
检测方法
目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类:
一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同,如离子层析法、电泳等方法;
另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。
其中高效液相离子层析法(HPLC)被公认为金标法。
1.离子层析法离子层析法精密度高、重复性好且操作简单,被临床广泛采用。
检测原理由于血红蛋白?
?
链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同,在偏酸溶液中总糖化血红蛋白(GHb)及HbA均具有阳离子的特性,因此经过阳离子交换层析柱时可被偏酸的缓冲液平衡过的树脂来吸附,但二者吸附率不同,GHb正电荷较少吸附率较低,HbA正电荷较多吸附率较高。
用不同pH的磷酸盐缓冲液可以分次洗脱出GHb和HbA,用KCN可将Hb转化为高铁氰化血红蛋白,用分光光度计测定。
或者得到相应的Hb层析谱,其横坐标是时间,纵坐标是百分比。
HbA1c值以百分率来表示。
现在大部分都用全自动测定仪测定,如日本TOSOH公司生产的全自动糖化血红蛋白分析仪曾应用于美国糖尿病控制和并发证试验(DCCT)研究,其离子交换HPLC法是HbA1c检测的金标准。
当前推出的HLC-723G7从开机到报告第一个结果仅需3.6min,标本无需前处理,操作维护都非常方便,是目前测试GHb精密度、准确性最高的方法。
国内主要采用Bio-Rex70阳离子树脂微柱层析法,其微柱可重复使用多次,更大型的仪器有SCIENTIFIC公司的Hb-Gold,除可全自动测定糖化血红蛋白外,还可分离检测血红蛋白的600多种变异体和亚型,用于地中海贫血等疾病的诊断。
但其缺点是价格昂贵,仅在一些发达国家使用,且容易受到如下干扰:
胎儿血红蛋白(HB-F)与HbA1c的带电性很相近,在离子交换HPLC分析图上可能呈现一个独立的Hb-F峰,也可能与HbA1c峰重叠(视离子交换柱的分辨能力而定)。
2.手工微柱法手式微柱操作会受到人工因素影响,可能会洗脱不完全或过度洗脱并受外界环境温度的影响,而某些血红蛋白如HbF异常增加时,也会与糖化血红蛋白同时洗脱,从而使结果产生偏差。
目前有Bio-Rad和西班牙BIOSYSTEMS等多家公司产品,相应的仪器以英国DREWSCIENTIFIC公司DS5糖化血红蛋白仪为例(Bio-Rad公司IASTA亦为同一产品),采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术可全自动分离血红蛋白的变异体与亚型,除可测定糖化血红蛋白外,还可同时检测出血红蛋白S(HbS)与血红蛋白C(HbC)的存在与否,在计算糖化血红蛋白值时会自动扣除变异体产生的影响,从而使结果更为准确,可靠,变异系数(CV)值<
2%。
同时该仪器配有专门的稀释溶血器,可直接进行全血操作,5min即可报告结果,并自动储存样品检测结果,层析柱价格也较为低廉,适合于较多标本的医院检测,但由于手工操作层析时间和微柱的质量不易控制,易产生操作技术误差,重复性欠佳。
3.琼脂凝胶电泳法Hb及HbA1带正电荷,电泳时向负极移动。
因为HbA的β链N-末端所带电荷被糖基消除,带电量少于HbA,等电点低,泳动速度慢,所以HbA1即GHb本身带红色,所以可直接比色或扫描。
用HbA1占Hb的量来表示。
毛细管电泳也能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体。
普通电泳法对HbA和HbA1分离效果不理想,目前尚无商品化且具有批量样本通过能力的仪器面世,相当程度地限制了该方法的临床应用。
4.等电点聚集法也是测定GHb的新技术,它是在聚丙烯酞凝胶中加人载体两性介质(如ampholin)的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度,溶血液中各个组份将移动到各自的等电点的pH位置上,这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带,通过分辨率高的微量光密度仪扫描,可以准确地测定出各自组份的含量。
由于它能够分辨出一级结构不同的HbA、HbAc、HbF、HbS及HbC等,可完全避开各种物质的干扰,是一种理想的方法,但仪器价格相当昂贵,难于用作常规检测。
5.亲和层析利用生物高分子能与相应的专一配基分子可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统,带有杂质的高分子分离目的物在一定条件下,能以某种次级键与已同相化的配基结合,而杂质则不吸附,除去杂质后变换条件,又可以使待分离的高分子物质重新解离,获得纯化。
GHb的亲和色谱载体是氨基苯硼酸琼脂糖凝胶,当总的GHb通过载体时,稳定型GHb分子表面含葡萄糖的顺式二糖醇部分与载体固定相上的硼酸基因呈配位特异结合,其它非糖化Hb及不稳定型GHb,HbF等,随流动相(天门冬酞胺缓冲液)流出,然后用另一种含糖或多经化合物流动相(山梨糖醇缓冲液)将GHb洗脱下来,利用两部分Hb本身的颜色,在415nm条件下测定并计算出亲和色谱所测的GHb。
英国DREWSCIENTIFIC公司的DST糖化血红蛋白分析仪是一种快速床边糖化血红蛋白仪。
它采用硼酸亲和层析法,只需10ul全血即可在4min内快速分离检测糖化血红蛋白,为临床提供即时的化验结果,从而使医生在患者就诊的第一时间明确诊断并制定相应的治疗方案,特别适合于临床科室使用,尤其对于小儿患者而言更有优势。
其检测结果也完全达到并超过临床要求,CV值在5%以内。
优点:
操作简单、快速、价廉,特异性强,不受异常血红蛋白的干扰,对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感,对血标本储存的时间也不象离子交换法那样严格。
缺点:
检测结果为糖化血红蛋白总量,不能测试GHb的单一组份,且包含HbA1的糖化组份,因此将亲和色谱所测出的GHb称为总的GHb是不确切的,严格来说是占不同百分数的各种GHb,目前对其测定内容的命名国内外尚不统一,目前日本化学工业株式会社所生产试剂盒称为糖化一亲和色谱GHb,以便与其他方法所测HbA,或HbAc相区别。
但并不影响它作为可靠的糖代谢指标的价值。
大量实验还证明,该法所测GHb值与HPLC等法所测HbA,HbAc及空腹、餐后2h血糖均呈高度相关,表明该法对糖尿病患者是一种较理想的病情监测指标。
6.离子捕获法近发展起来的新方法,代表仪器有Abbott的IMX,其原理是糖化血红蛋白与相应抗体结合后,联以荧光标记物,形成一反应复合物,再联结带负电荷的多聚阴离子复合物,而在IMX反应孔中的玻璃纤维预先包被了高分子的四胺合物,使纤维表面带正电,使前述的反应复合物吸附在纤维表面,经过一系列清洗后测定其荧光强度,从而得到糖化血红蛋白的浓度,该方法适用于成批糖化血红蛋自标本的检测。
7.免疫凝集法糖化血红蛋白与相应的单抗结合进而发生凝集反应,通过测定吸光度来表示凝集量,可用于全自动生化分析仪上进行测定。
以免疫分析为基础的仪器(DCA2000)在最近几年中得到推广,约在7min内就能读取数据,要求对样品成批试验,每次试验均应使用一个新试剂盒,操作前应注意混匀试剂。
免疫比浊法重复性较好,但易受脂肪血、黄疸等样本因素影响,抗交叉污染较差,而且要求血红蛋白在一定范围之间才能达到较好的线性。
8.金标免疫渗滤法(金标法)免疫渗滤法,操作较简便,目前代表仪器有挪威NycoCardReaderII特种蛋白多功能全定量金标检测仪。
9.化学发光法采用离子捕捉免疫分析法,应用抗原抗体反应原理,联以荧光标记物,通过连接带负电的多阴离子复合物,吸附到带正电的纤维表面,经过一系列彻底清洗等步骤后,测定荧光强度变化率,计算浓度。
采用专用试剂包和免疫发光分析仪,其检测系统易于规范和重复,可减少操作技术误差,检测的灵敏度和特异性高,批内、批间变异系数小,回收率高,准确度高,交叉污染率小,影响因素少。
10.放射免疫法优点:
精密度高、特异性强、快速、价格相对便宜,可批量测试,且不受各种干扰因素的影响。
目前对制备高效价的抗体尚存在许多困难,仍处于研究中,未能形成商品化试剂盒。
11.酶法原理为用特殊蛋白酶分解Hb,3~5min内果糖基氨基酸从Hb分离,果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)从果糖基氨基酸产生H2O2,H2O2经POD与DA-64反应,选择751nm测吸光度改变求得GHb浓度
操作过程
血样
1、操作方法
(1)收集静脉血、加入EDTA抗凝。
(2)根据样品数取试管若干,分别吸取400μl溶血剂加入各试管中。
(3)分别吸取80μl标准或样本放入上述各试管中,混合均匀。
(4)放置5~10min,则制成了血红蛋白样本A3。
2、糖化血红蛋白的制备及测定
(1)根据样品的数量,取干净的试管若干,分别吸取3.0ml阳离子树脂,放入各管中。
(2)向上述试管中分别加入已预备的100μl血红蛋白样本(A3)。
将层析柱插入试管中,使得橡皮塞高于液面至少1cm。
(3)充分摇荡试管混合5~10min(最好使用涡旋摇荡器,如果没有则需剧烈摇荡20min。
(4)然后慢慢推动层析柱进入试管,直到糖化血红蛋白提取完全。
(5)上清液倒入另一支试管或直接倒入比色杯进行比色。
(6)以蒸馏水作空白在415nm调零。
(7)读取并记录标准,样品吸光度值。
3、总血红蛋白测定
(1)根据样品数量取试管若干,分别加入5.0ml蒸馏水。
(2)加入20μl血红蛋白样本(A3)。
混合均匀。
(3)以蒸馏水作空白在415nm调零。
(4)读取并记录各管吸光度值。
计算:
糖化血红蛋白吸光度总血红蛋白吸光度×
10=糖化血红蛋白%(正常值范围6.0%~8%)。
监测意义
糖化血红蛋白的特点决定了它在糖尿病监测中有很大的意义:
(1)与血糖值相平行。
血糖越高,糖化血红蛋白就越高,所以能反映血糖控制水平。
(2)生成缓慢。
由于血糖是不断波动的,每次抽血只能反映当时的血糖水平,而糖化血红蛋白则是逐渐生成的,短暂的血糖升高不会引起糖化血红蛋白的升高;
反过来,短暂的血糖降低也不会造成糖化血红蛋白的下降。
由于吃饭不影响其测定,故可以在餐后进行测定。
(3)一旦生成就不易分解。
糖化血红蛋白相当稳定,不易分解,所以它虽然不能反映短期内的血糖波动,却能很好地反映较长时间的血糖控制程度,糖化血红蛋白能反映采血前2个月之内的平均血糖水平。
(4)较少受血红蛋白水平的影响。
糖化血红蛋白是指其在总血红蛋白中的比例,所以不受血红蛋白水平的影响。
控制标准
糖化血红蛋白能够反映过去2~3个月血糖控制的平均水平,它不受偶尔一次血糖升高或降低的影响,因此对糖化血红蛋白进行测定,可以比较全面地了解过去一段时间的血糖控制水平。
世界权威机构对于糖化血红蛋白有着明确的控制指标,ADA(美国糖尿病学会)建议糖化血红蛋白控制在小于7%,IDF(国际糖尿病联盟)建议糖化血红蛋白控制标准为小于6.5%,目前我国将糖尿病患者糖化血红蛋白的控制标准定为6.5%以下。
糖化血红蛋白与血糖的控制情况 4%~6%:
血糖控制正常。
6%~7%:
血糖控制比较理想。
7%~8%:
血糖控制一般。
8%~9%:
控制不理想,需加强血糖控制,多注意饮食结构及运动,并在医生指导下调整治疗方案。
>
9%:
血糖控制很差,是慢性并发症发生发展的危险因素,可能引发糖尿病性肾病、动脉硬化、白内障等并发症,并有可能出现酮症酸中毒等急性合并症。
美国糖尿病协会(ADA),欧洲糖尿病协会(EASD)以及国际糖尿病联合会(IDF)现已达成共识,未来糖化血红蛋白的单位将采用国际临床化学联合会(InternationalFederationofClinicalChemistry,IFCC)标准。
单位的转换可使用以下公式:
IFCC-HbA1c(毫摩尔/摩尔)=[DCCT-HbA1c(%)-2.15]×
10.929
DCCT-HbA1c
IFCC-HbA1c
(%)
(毫摩尔/摩尔)
4.0
20
5.0
31
6.0
42
6.5
48
7.0
53
7.5
59
8.0
64
9.0
75
10.0
86
结果解释
实验室的检测结果可能因分析手段、样品保存时间和个体差异而不同。
两个平均血糖相同的人,糖化血红蛋白可能会有多至3%的差异。
结果也可能因多种因素而不可靠,如:
手术后失血,输血,贫血,高红细胞更新率,慢性肾功能衰竭,肝脏疾病,高剂量维生素C摄入,红细胞生成素治疗等等。
大致来说,健康人糖化血红蛋白的参考范围大约是4%–5.9%。
糖化血红蛋白水平与估计的平均血糖水平的对应关系可由以下的近似公式得出:
估计的平均血糖(毫克/分升)=28.7×
糖化血红蛋白−46.7
估计的平均血糖(毫摩尔/升)=1.59×
糖化血红蛋白−2.59
(表格中的数据置信区间为95%):
糖化血红蛋白
估计的平均血糖
(毫摩尔/升)
(毫克/分升)
5
5.4(4.2–6.7)
97(76–120)
6
7.0(5.5–8.5)
126(100–152)
7
8.6(6.8–10.3)
154(123–185)
8
10.2(8.1–12.1)
183(147–217)
9
11.8(9.4–13.9)
212(170–249)
10
13.4(10.7–15.7)
240(193–282)
11
14.9(12.0–17.5)
269(217–314)
12
16.5(13.3–19.3)
298(240–347)
尽管高糖化血红蛋白水平代表着血糖控制不佳,但即便是“好的”糖化血红蛋白水平仍可能为段时间内的低血糖导致。
因此,常规的血糖监测仍然是最佳的血糖控制分析方法。
由于糖尿病患者糖化血红蛋白的水平与平均血糖的控制相关,国际糖尿病病联合会(IDF)建议大多数糖尿病患者将糖化血红蛋白控制在6.5%以下,而美国糖尿病协会(ADA)的推荐标准则是7.0%以下。
最近一些研究结果认为7%以下的控制目标过于严格,可能导致比较严重的低血糖发生。
因此医疗人员在制定糖化血红蛋白控制目标时,必须考虑患者个人的健康状况、低血糖风险、特殊健康风险等具体情况。
例如,对于青少年和儿童1型糖尿病患者,糖化血红蛋白的控制目标和成人有所不同,因为这部分人群血糖多变不易控制,而且在发育中的大脑比成年人的大脑更容易受到低血糖的损害,所以血糖控制不宜过分严格,美国糖尿病协会(ADA)给出的建议可参考下表:
不同年龄段青少年儿童控制目标
年龄
糖化血红蛋白(HbA1c)控制目标
<
6岁
7.5%-8.5%
6~12岁
8.0%
13~19岁
7.5%
注意事项
发现治疗中存在的问题。
如果糖尿病患者经常监测血糖都显示控制较好,而糖化血红蛋白偏高,则需考虑是否平时监测血糖不够全面(如只测空腹血糖而忽略了餐后血糖),或者可能血糖仪测出的数值不够准确(如机器老化,试纸受潮、过期等)。
如果某位糖尿病患者血糖波动较大,经常发生低血糖,继而又发生高血糖,由于糖化血红蛋白是反应血糖的平均值,所以其糖化血红蛋白完全有可能维持在正常范围。
在这种情况下,它的数值就不能反映真正的血糖变化了。
同时,糖化血红蛋白还受红细胞的影响,在合并影响红细胞质和量的疾病(如肾脏疾病、溶血性贫血等)时,所测得的糖化血红蛋白也不能反映真正的血糖水平。
指导治疗方案的调整。
在临床治疗中,如能同时测定血糖与糖化血红蛋白,可以更好地全面判断病情,及时调整治疗方案。
当空腹血糖超过患者糖化血红蛋白对应的预测值时,则显示近期血糖控制不好,可能与采血时紧张、劳累、晚餐进食过多、治疗不当、急性并发症等有关,需要调整治疗方案。
比如某糖尿病患者定期监测糖化血红蛋白均在6%~7%,而最近一次为8.2%,这表明以往的治疗方案已不能较好地控制血糖,需要重新调整方案。
相反,如果空腹血糖低于糖化血红蛋白对应的预测值,甚至达到正常标准,则显示近期血糖控制良好,治疗对症。
因此,普及糖尿病知识,更新治疗理念,监测并保持糖化血红蛋白达标,更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗,对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要。
目前临床提倡对2型糖尿病患者采取积极治疗方法:
尽早药物治疗、尽早联合治疗。
糖尿病患者血糖控制未达到目标或治疗方案调整后,应每3个月检查一次糖化血红蛋白;
血糖控制达到目标后也应每年至少检查2次糖化血红蛋白。
临床意义
临床上,只有30%左右的糖尿病患者能做到定期监测糖化血红蛋白。
良好的血糖控制是预防并发症的关键,而血糖监测在很大程度上取决于患者本人的认知和行动。
由于大部分患者选择可靠性不高的日常监测手段,目前超过60%的2型糖尿病患者的糖化血红蛋白控制不理想。
糖化血红蛋白长期控制不稳定的影响是多方面的,它会改变红细胞对氧的亲和力,加速心脑血管并发症的形成;
如果眼睛内的晶体被糖化,则会引发白内障。
此外,它可引起肾小球基底膜增厚,诱发糖尿病肾病,并引起血脂和血粘度增高。
糖化血红蛋白升高,是心肌梗死、脑卒中死亡的一个高危因素。
在男性患者中,糖化血红蛋白每增加1%,死亡率的相对危险性增加24%,女性患者增加28%。
一旦糖化血红蛋白超过7%,发生心脑血管疾病的危险性就增加50%以上。
糖尿病患者的糖化血红蛋白控制
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