elisa酶联免疫吸附实验报告docx文档格式.docx
- 文档编号:22657515
- 上传时间:2023-02-05
- 格式:DOCX
- 页数:8
- 大小:21.53KB
elisa酶联免疫吸附实验报告docx文档格式.docx
《elisa酶联免疫吸附实验报告docx文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《elisa酶联免疫吸附实验报告docx文档格式.docx(8页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。
本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。
因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面:
1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被:
用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
(简称洗涤,下同)。
2. 加样:
加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:
于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
5. 终止反应:
于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:
可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:
反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。
也可测O•D值:
在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O•D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
基本方法二 用于检测未知抗体的间接法:
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。
次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)
于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
(二)酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。
是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物
酶底物显色反应测定波长
辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*
四甲替联苯胺黄色460**
氨基水杨酸棕色449
邻联苯甲胺兰色425
2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色642
碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)黄色400
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500
葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405,420
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色
β-D-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)荧光360,450
硝基酚半乳糖苷(ONPG)黄色420
*终止剂为2mol/LH2SO4
**终止剂为2mol/L柠檬酸,不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应:
HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+AAH2——为无色底物,供氢体;
A——为有色产物。
(三)ELISA常用的四种方法
1.直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面;
加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物;
加底物。
底物的降解量=抗原量。
2.间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面;
加抗体,形成抗原-抗体复合物;
加酶标抗体;
测定底物的降解量=抗体量。
3.双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原,形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);
4.竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
(1)加入酶标抗原;
(2),(3)加入酶标抗原和待测抗原;
对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。
三.仪器和材料
1.聚苯乙烯微量细胞培养板(平板,40,96孔)。
2.酶联免疫检测仪
3.辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,工作稀释度1:
1000。
4.包被液:
:
0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO30.15克,NaHCO30.293克,蒸馏水稀释至100ml。
5.稀释液:
0.01mol/LpH7.4PBS--Tween--20,4℃,保存.NaCl8g,KH2PO40.2g,Na2HPO4.12H2O2.9g,Tween—20,0.5ml.蒸馏水加至1000ml。
6.洗涤液:
同稀释液
7.封闭液:
0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4PBS。
8.邻苯二胺溶液(底物):
临用前配制0.1M柠檬酸(2.1g/100ml),6.1ml0.2MNa2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml,蒸馏水12.5ml,邻苯二胺10mg,溶解后,临用前加30%H2O240微升。
9.终止液:
2mol/LH2SO4。
四.操作步骤
1.包被抗原:
用包被液将抗原作适当稀释,一般为1~10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16~18小时。
2.洗涤:
倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,最后将反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
3.加封闭液200微升,37℃放置一小时。
4.洗涤同2。
5.加被检血清:
用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6.洗涤同2。
7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200微升,放置37℃1小时。
8.洗涤同2。
9.加底物:
邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟。
10.加终止液:
每孔50微升。
11.观察结果:
用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
赠送以下资料
考试知识点技巧大全
一、考试中途应饮葡萄糖水
大脑是记忆的场所,脑中有数亿个神经细胞在不停地进行着繁重的活动,大脑细胞活动需要大量能量。
科学研究证实,虽然大脑的重量只占人体重量的2%-3%,但大脑消耗的能量却占食物所产生的总能量的20%,它的能量来源靠葡萄糖氧化过程产生。
据医学文献记载,一个健康的青少年学生30分钟用脑,血糖浓度在120毫克/100毫升,大脑反应快,记忆力强;
90分钟用脑,血糖浓度降至80毫克/100毫升,大脑功能尚正常;
连续120分钟用脑,血糖浓度降至60毫克/100毫升,大脑反应迟钝,思维能力较差。
我们中考、高考每一科考试时间都在2小时或2小时以上且用脑强度大,这样可引起低血糖并造成大脑疲劳,从而影响大脑的正常发挥,对考试成绩产生重大影响。
因此建议考生,在用脑60分钟时,开始补饮25%浓度的葡萄糖水100毫升左右,为一个高效果的考试加油。
二、考场记忆“短路”怎么办呢?
对于考生来说,掌握有效的应试技巧比再做题突击更为有效。
1.草稿纸也要逐题顺序写草稿要整洁,草稿纸使用要便于检查。
不要在一大张纸上乱写乱画,东写一些,西写一些。
打草稿也要像解题一样,一题一题顺着序号往下写。
最好在草稿纸题号前注上符号,以确定检查侧重点。
为了便于做完试卷后的复查,草稿纸一般可以折成4-8块的小方格,标注题号以便核查,保留清晰的分析和计算过程。
2.答题要按先易后难顺序不要考虑考试难度与结果,可以先用5分钟熟悉试卷,合理安排考试进度,先易后难,先熟后生,排除干扰。
考试中很可能遇到一些没有见过或复习过的难题,不要蒙了。
一般中考试卷的题型难度分布基本上是从易到难排列的,或者交替排列。
3.遇到容易试题不能浮躁遇到容易题,审题要细致。
圈点关键字词,边审题边画草图,明确解题思路。
有些考生一旦遇到容易的题目,便觉得心应手、兴奋异常,往往情绪激动,甚至得意忘形。
要避免急于求成、粗枝大叶,防止受熟题答案与解题过程的定式思维影响,避免漏题,错题,丢掉不该丢的分。
4.答题不要犹豫不决选择题做出选择时要慎重,要关注题干中的否定用词,对比筛选四个选项的差异和联系,特别注意保留计算型选择题的解答过程。
当试题出现几种疑惑不决的答案时,考生一定要有主见,有自信心,即使不能确定答案,也不能长时间犹豫,浪费时间,最终也应把认为正确程度最高的答案写到试卷上,不要在答案处留白或开天窗。
5.试卷检查要细心有序应答要准确。
一般答题时,语言表达要尽量简明扼要,填涂答题纸绝不能错位。
答完试题,如果时间允许,一般都要进行试卷答题的复查。
复查要谨慎,可以利用逆向思维,反向推理论证,联系生活实际,评估结果的合理性,选择特殊取值,多次归纳总结。
另外,对不同题型可采用不同的检查方法。
选择题可采用例证法,举出一两例来能分别证明其他选项不对便可安心。
对填空题,则一要检查审题;
二要检查思路是否完整;
三要检查数据代入是否正确;
四要检查计算过程;
五要看答案是否合题意;
六要检查步骤是否齐全,符号是否规范。
还要复查一些客观题的答案有无遗漏,答案错位填涂,并复核你心存疑虑的项目。
若没有充分的理由,一般不要改变你依据第一感觉做出的选择。
6、万一记忆短路可慢呼吸考试中,有些考生因为怯场,导致无法集中精神,甚至大脑忽然一片空白,发生记忆堵塞。
此时不要紧张,不妨尝试如下方式:
首先是稳定心态,保持镇静,并注意调节自己的呼吸率。
先慢吸气,当对自己说放松时缓慢呼气,再考虑你正在努力回忆的问题,如果你仍不能回想起来,就暂时搁下这道题,开始选做其他会的试题,过段时间再回过头来做这道题。
第二,积极联想。
你不妨回忆老师在讲课时的情景或自己的复习笔记,并努力回忆与发生记忆堵塞问题有关的论据和概念,把回忆起的内容迅速记下来,然后,看能否从中挑出一些有用的材料或线索。
第三,进行一分钟自我暗示。
即根据自己的实际,选择能激励自己,使自己能心情平静和增强信心的话,在心中默念3至5遍。
比如:
我已平静下来,我能够考好、我有信心,一定能考出理想的成绩等等。
第四,分析内容,查找相关要点。
借助试卷上其它试题,也许会给考生提供某些线索。
因此不要轻易放弃,查看试题中的相关要点,看看是否能给考生提供线索或启发。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- elisa 免疫 吸附 实验 报告 docx
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)