结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答Word文档格式.docx
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为进一步阐述海藻糖磷酸磷酸酶(trehalose-6-phosphatephosphatase,TPP,由otsB2基因编码)的生物学功能,我们对TPP做了亚细胞定位,发现TPP存在于结核分枝杆菌和BCG的细胞壁和细胞膜上。
分别用TPP蛋白和BCG免疫小鼠,检测了TPP诱导的小鼠体液和细胞免疫反应。
材料和方法
1.实验菌种和培养条件大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)分别用于克隆和表达TPP。
大肠杆菌在含有25μg/ml的卡那霉素的LB培养基中培养。
结核分枝杆菌和BCG用改良苏通培养基或含有10%(v/v)oleicacid-albumin-dextrosecomplex的Middlebrook7H10琼脂培养。
2.TPP的表达纯化以及兔抗TPP血清的制备从结核分枝杆菌H37Rv基因组中克隆TPP编码基因otsB2,然后在E.coli.BL21(DE3)中表达,通过Ni-NTA亲合层析纯化TPP蛋白。
0.2mg纯化的TPP蛋白与弗氏不完全佐剂混合皮下多点免疫3个月的新西兰白兔,然后加强免疫4次,制备抗血清。
3.分枝杆菌的亚细胞分离收集对数生长早期的结核分枝杆菌H37Rv和BCG。
培养上清通过0.22um的虑膜过滤,冷冻干燥浓缩后,在PBS中透析,获得培养上清滤过性蛋白。
分枝杆菌菌体用PBS清洗2次后,悬浮于含有蛋白酶抑制剂的PBS中,超声破碎。
裂解液11000g离心5min,去除没有破碎的菌体。
裂解液上清27000g离心1h,得到的沉淀为细胞壁组份。
上清100000g继续离心4h分离细胞膜(沉淀)和细胞质(上清)。
用PBS分别清洗细胞壁和细胞膜组份3次。
细胞质组份继续在100000g离心4h,以保证所有的细胞膜组份分离出细胞质组份。
所分离的各细胞组份用每种组份的抗体识别分子标签鉴定,例如细胞质65kDa蛋白、细胞膜38kDa蛋白、细胞壁分泌性蛋白Ag85的特异性抗体。
4.Western杂交所有的细胞组份悬浮于PBS中,SDS-PAGE(10%,w/v丙稀酰胺)每个泳道上样量为相当于500μl培养液分离所得到的蛋白。
电泳后将蛋白电转到PVDF膜上,用制备的兔抗TPP血清做一抗,羊抗兔IgG抗体做二抗检测。
5.实验动物及动物免疫C57BL/6小鼠(25g,雌性),购于上海第二军医大学;
随机分为4组。
收集的BCG菌体悬浮于PBS中,终浓度约为200mg/ml。
BCG免疫组(4只)的每只小鼠皮下注射100μl(涂板计数为5×
106CFU)的BCG悬浮液,PBS对照组的每只小鼠皮下注射100μl的PBS。
TPP蛋白免疫组(4只)的小鼠每周皮下注射与弗氏不完全佐剂(IFA)混匀的50μg的TPP蛋白,总共免疫3次。
IFA对照组小鼠用IFA免疫。
6.ELISA测定IgG1和IgG2a收集BCG和PBS免疫组小鼠免疫3周后的血清,以及蛋白TPP和IFA免疫组小鼠最后一次免疫1周后的血清。
ELISA检测血清中TPP特异性IgG1和IgG2a抗体滴度。
并与分枝杆菌抗原85B(Ag85B)做比较。
酶标板(Nunc)用5μg/ml的纯化蛋白(TPP或Ag85B)100μl/孔包被,4°
C过夜;
用含有1%BSA的PBST封闭2h;
待测血清用含有1%BSA的PBST稀释1250倍,然后再等倍稀释。
加入待测血清100μl,37°
C孵育1h;
HRP标记的羊抗鼠IgG1或IgG2a作为二抗,每孔100μl,37°
每孔加100μlOPD显色液,37°
C闭光反应20min,每孔加50μl7%H2SO4终止反应,于492nm波长处读取吸光度值。
7.ELISPOT检测IFN-γ无菌取出小鼠脾脏,研碎后经尼龙网过滤得到单细胞;
用淋巴细胞分离液(CedarlanLab)分离小鼠淋巴细胞。
然后用IFN-γELISPOT检测试剂盒(U-CytechBV,Ultrecht,TheNetherlands)检测分泌IFN-γ的淋巴细胞。
每孔加入100μl5×
105淋巴细胞。
分别用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml的蛋白TPP和2μg/ml蛋白Ag85B刺激48h。
按照IFN-γELISPOT检测试剂盒使用说明操作,最后在倒置显微镜下观察并计数。
结果
1.TPP在结核分枝杆菌和BCG中的亚细胞定位BLAST分析目前已有的分枝杆菌基因组序列,发现TPP广泛地存在于分枝杆菌中。
结核分枝杆菌H37Rv的TPP蛋白序列与牛分枝杆菌AF2122/97的TPP100%同源,与结核分枝杆菌CDC1551的TPP蛋白100%同源,与M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10的TPP蛋白71%同源,与M.lepraeTN的TPP蛋白67%同源,与M.smegmatis的TPP25%同源。
将分离获得的结核分枝杆菌H37Rv和BCG的培养上清滤过性蛋白、细胞壁、细胞膜,和细胞质组份通过Western杂交检测,发现42kDa的TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌和BCG的细胞壁和细胞膜上(图1)。
2.TPP在不同株的结核分枝杆菌中的表达情况结核分枝杆菌H37Rv基因组中存在另一个与TPP(由otsB2编码)同源的海藻糖磷酸磷酸酶,由otsB1编码(Sangerwebsite;
www.sanger.ac.uk)。
Edavan等实验证明OtsB1蛋白没有磷酸酶的活性。
由42kDaTPP制备的抗体不与146kDaOtsB1蛋白产生交叉反应。
结核分枝杆菌中某些具有两个或三个同源蛋白的酶可能是假基因或者开放阅读框发生移码突变。
我们检测了TPP在不同的结核分枝杆菌临床分离株中的表达情况(图2)。
所选用的临床分离株是本实验室曾通过DNA指纹证明为流行病学上不相关的菌株。
Western杂交表明TPP完整地存在于结核分枝杆菌临床分离株中。
3.TPP诱导特异性体液免疫C57BL/6小鼠分别用BCG和TPP免疫,对照组分别用PBS和IFA免疫。
分别检测IgG1和IgG2a抗体的效价(图3)。
TPP蛋白免疫组的小鼠具有较高的抗体滴度,并且TPP特异的IgG2a抗体滴度高于IgG1。
然而在BCG免疫组中IgG1和IgG2a抗体滴度都很低。
我们用能有效诱导的体液和细胞免疫的分枝杆菌保守抗原Ag85B作为本实验的对照,发现Ag85B特异的IgG1和IgG2a抗体比TPP高。
用PBS或IFA免疫的阴性对照小鼠血清中几乎检测不到IgG1或IgG2a的抗体。
4.TPP诱导特异性细胞免疫IgG2a抗体与I型辅助性T细胞介导的免疫反应相关,I型辅助性T细胞介导的免疫反应产生IFN-γ。
TPP蛋白或BCG免疫小鼠的脾细胞经TPP体外刺激后都能产生较高的IFN-γ(p<
0.05)(图4)。
对于TPP蛋白免疫组,分别用1μg/ml、2μg/ml和5μg/mlTPP体外刺激小鼠脾细胞,IFN-γ水平增加了3到7倍;
而BCG免疫组小鼠的脾细胞IFN-γ水平增加了20到24倍。
用2μg/ml的TPP或Ag85B分别刺激BCG免疫的小鼠脾细胞,前者所检测到的分泌IFN-γ脾细胞的数目是后者的60%。
定位于BCG细胞壁和细胞膜上的TPP能诱导IFN-γ的分泌,是典型的I型辅助性T细胞介导的免疫反应。
讨论
本文首次研究了分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶的免疫原性。
在结核分枝杆菌和BCG中编码该蛋白的基因序列完全相同。
我们克隆并表达了该蛋白,纯化的TPP的酶活性跟报道的一致[4]。
TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌和BCG的细胞壁和细胞膜上。
TPP蛋白的抗体能抑制结核分枝杆菌的增值(图5),该现象佐证了otsB2基因缺失突变的是致死的。
我们实验室曾经发现TPP在异烟肼耐药的结核分枝杆菌中上调表达。
TPP可能是结核化疗治疗的潜在药靶,也可能为异烟肼耐药结核病的诊断提供了新的分子标志物。
通过检测IgG1/IgG2a抗体滴度以及脾细胞分泌IFN-γ的水平,我们分析了TPP是诱导I型还是II型辅助性T细胞介导的免疫反应。
较强的细胞免疫和高滴度的IgG2a抗体水平是I型辅助性T细胞介导的免疫反应的特征;
而高滴度的IgG1和IgGE抗体水平是II型辅助性T细胞介导的免疫反应的特征。
本研究表明TPP诱导小鼠I型辅助性T细胞介导的免疫反应,表现为IgG2a的抗体滴度高于IgG1(在抗血清稀释1,250倍时,抗体滴度IgG2a/IgG1为1.46:
1)以及抗原刺激脾细胞分泌IFN-γ。
不同的佐剂可能对TPP特异性体液免疫的诱导有不同的影响,例如单磷酸基脂质A、氯化二甲基二八癸胺、几丁质颗粒等。
不同免疫佐剂对TPP诱导体液免疫的影响有待于进一步研究。
对于BCG免疫的小鼠,Ag85B特异性IgG1和IgG2a抗体滴度以及抗原刺激脾细胞所分泌的IFN-γ的水平都要高于TPP。
Ag85B是一种分枝杆菌分泌性蛋白,能诱导有效的体液和细胞免疫。
TPP亚细胞定位于BCG的细胞壁和细胞膜上,生物信息学分析表明在TPP的N端没有分泌的信号肽。
因此BCG免疫的小鼠不能有效诱导体液免疫,却能诱导较强的细胞免疫。
BCG诱导的细胞免疫反应优于TPP蛋白,这可能与BCG在小鼠体内能不断增值并表达TPP蛋白以及体外免疫TPP蛋白的不稳定性有关。
对TPP有效抗原表位的分析鉴定以及构建胞外分泌性表达TPP的重组BCG有助于开发新的抗结核疫苗。
细胞免疫反应是控制结核的关键。
然而细胞免疫是一把双刃剑:
一方面,适当的免疫反应能清除并控制病原;
另一方面,所产生免疫反应能增强病原的存活。
因此我们今后会进行TPP对动物的保护性实验,来检测42kDa的TPP能否使机体对结核分枝杆菌的感染产生抵御作用。
图1TPP在M.tuberculosisH37Rv和BCG中的亚细胞定位
Figure1.SubcellularlocalizationofTPPinM.tuberculosisH37RvandBCG
Sonicatedpreparationsofmycobacteriawerefractionatedintocellwall,cellmembraneandcytosolfractions,asdescribedinMethods.ThefractionswereWesternblottedtorabbitserumraisedagainstrecombinantTPPprotein.Line1-4,culturefiltrate(CF),cellwall(CW),cellmembrane(CM),andcytosol(CY)fractionsfromM.tuberculosisH37Rv;
Line5-8,CF,CW,CM,CYfractionsfromBCG.
图2TPP在M.tuberculosis不同临床分离株中的表达情况
Figure2.DistributionofTPPamongM.tuberculosisstrains
RabbitserumraisedtorecombinantTPPproteinwasimmunoblottedtosonicatedantigenpreparationsobtainedfromBCG
(1),avirulentstrainofM.tuberculosisH37Ra
(2),M.tuberculosisH37Rv(3),andfourclinicalM.tuberculosisisolates(4-7).
图3TPP特异性IgG1和IgG2a抗体滴度的测定
Figure3.AnalysisofIgG1andIgG2aantibodyresponsesagainstpurifiedTPP
MicewereimmunizedwithTPPemulsifiedwithIFA(●)orIFA(■),SerawereassayedbyELISAusingsecondaryantibodiesspecificformouseIgG1(A)andIgG2a(B);
MicewereimmunizedwithBCG(▲)orPBS(△).LevelsofIgG1(C)andIgG2a(D)antibodiesagainstpurifiedTPP(solidlines)orAg85B(dashedlines)weredeterminedinseraofmice3weekspost-immunization.
图4ELISPOT检测TPP蛋白或BCG免疫C57BL/6小鼠分泌IFN-γ的脾细胞计数
Figure4.ThecellularimmuneresponsewasmeasuredinanELISPOTassaywithsplenocytesisolatedfromC57BL/6miceimmunizedwithproteinTPPorBCG
Splenocytes(5×
105cellperwell)werestimulatedwith1μg/ml,2μg/mland5μg/mlpurifiedTPP,respectively.FortheBCG-immunizedmicethesplenocyteswerealsostimulatedwith2μg/mlAg85B.
图5M.tuberculosisH37Rv在加入不同浓度的TPP兔抗血清后体外培养2周的存活率
Figure5.TherelationshipofthesurvivalofM.tuberculosisH37Rvover2weeksinthepresenceofdifferentconcentrationsofrabbit-antiserumraisedagainstTPP
Therabbitsera,collectedpre-andpost-immunizationwithantigenTPP,wereaddedintotheculturesofM.tuberculosisH37Rvintheearlymidloggrowthphase.Thecolonyformingunits(CFUs)weretestedafter2weekscultureinvitro.
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