植物细胞工程重点Word格式.docx
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第二章:
培养基的成分:
1.无机营养物(无机盐)2.碳源和能源3.维生素类4.氨基酸及有机附加物(氨基酸、维生素、肌醇、天然复合物)5.植物生长调节物质6.琼脂7.活性炭
无机营养物(无机盐):
大量元素CHONPSKCAMgCl微量元素FeMnBZnMoCuCo
N:
蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分,在植物生命活动中占有重要的位置。
满足培养物对氮的需求,胚胎发生所需要的元素之一
P:
磷脂的主要成分,参与植物生命活动中核酸以及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量储存、转化与释放等重要的生理过程
K:
对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。
Mg、S、Ca:
叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂,对核蛋白体结构具有稳定作用;
S:
含S氨基酸的蛋白质的组成成分。
Ca:
构成细胞壁的成分,对细胞分裂,稳定质膜结构有显著作用,此外,Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。
铁:
氧化酶的组成成分,又是叶绿素形成的必要条件。
硼:
与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系;
铜:
某些氧化酶的成分,能够促进离体根的生长;
锰:
与植物的光合、呼吸代谢;
钼:
参与氮素的代谢;
氯:
光合作用水光解的活化剂。
VB1:
促愈伤组织产生,提高活力
VB6:
促根生长
Vpp(烟酸):
与代谢和胚发育有关
Vc:
防组织褐变
肌醇:
促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成,对组织细胞繁殖、分化的促进作用
天然复合物:
提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等
碳源和能源:
主要是蔗糖、葡萄糖。
作为离体组织赖以生长的碳源,使培养基维持一定的渗透压
植物生长调节物质:
1.生长素类种类:
IBA—吲哚丁酸;
IAA—吲哚乙酸;
NAA—萘乙酸;
2,4-D---2,4-二氯苯氧乙酸。
作用 诱导愈伤组织和根分化,促进细胞分裂和伸长。
配制生长素可溶解在稀NaOH中或溶于乙醇。
2.细胞分裂素类(CTK)种类:
6-BA---苄氨基腺嘌呤、Kt---激动素、2-iP---异戊烯腺嘌呤、ZT-玉米素、TDZ作用:
促进细胞的分裂和器官的分化,延缓组织的衰老,增强蛋白质的合成,一直顶端优势,促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。
生长素/细胞分裂素:
高:
有利于根的形成和愈伤组织的形成;
适中:
有利于根芽的分化;
低:
有利于芽的形成
赤霉素:
促茎伸长,促胚发育成植株;
打破休眠;
一般在器官形成后加入。
琼脂:
固化作用
活性炭:
吸附作用,利于某些植物生根,有利于胚胎培养
抗生素:
抑制内生菌
抗氧化物:
防止氧化
配制培养基母液时要用蒸馏水或重蒸馏水,以保持母液及培养基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变质。
药品:
应选取等级较高的化学纯(CP)或分析纯(AR)
母液(贮备液,stocksolution)配制的目的:
1)方便配制其他培养基;
2)保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取
3)便于低温保藏。
母可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。
母液配制方法:
(1)单配法:
将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。
(2)混配法:
将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量,分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液.
培养基的种类:
根据其态相不同分为固体培养基和液体培养基,根据培养物的培养过程分为初代培养基和继代培养基,根据其作用不同分为诱导培养基、增殖培养基、生根培养基,根据其营养水平不同分为基本培养基和完全培养基。
第三章
茎尖是最好的部位:
形态已基本形成,生长速度快,遗传性稳定,也是获得无病毒苗的重要途径
外植体选择的原则:
1.培养材料的来源是否保证
2.是否会引起不良变异。
3.叶片的来源最有保证,许多植物的组织培养以叶片为外植体。
4.对一些培养较困难的植物,利用子叶或下胚轴
取材季节:
在生长开始的季节取材,若在生长末期或已进入休眠时取样,则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
器官的生理状态和发育年龄:
1.通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力,容易培养,有较大的再生能力。
2.植物上部器官的生长时间虽短,其生理年龄却较老。
而越向基部,则生理年龄越小。
3.上部组织容易形成花器官,下部组织越易形成营养器官。
选取适宜大小:
材料太大易污染;
材料太小,难于成活。
外植体的灭菌方法
预处理:
先对植物组织修整,去掉不需要的部分,流水中冲洗干净。
70%的酒精中约30s,用0.1%的升汞(HgCl2)中浸泡5-10min,无菌蒸馏水冲洗3~5次
污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败的现象。
第四章:
接种:
把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞,并将它们转到无菌培养基上的全部操作过程。
注意接种操作,防止污染,分布均匀(外植体必须与培养基紧密接触,在培养容器内均匀分布,以保证营养的充分利用,以及光照条件均匀一致),注意对象:
1.种子和分生组织:
培养时通常将其贴放在培养基表面,而不是插到培养基内部,以免供氧不足。
2.接种茎段:
注意形态学下端插入培养基内,而形态学上端露于空气中
3.接种带腋芽的茎段:
将茎段平放在培养基上,可破除顶端优势,有利腋芽生长。
培养方法:
固体培养和液体培养。
固体培养:
优点:
简单,应用广泛。
缺点:
1.外植体或愈伤组织只有底部表面接触培养基、吸收养分,造成各部分营养浓度差异,影响生长。
2.外植体插入培养基后,气体交换不畅及排泄物质积累,影响组织吸收和造成毒害。
3.受光不均匀,生长不一致。
液体培养:
分静止培养和振荡培养(连续浸没,定期浸没)
静止液体培养优点:
1.培养基中不出现营养物浓度差异的现象,用来进行许多营养方面的研究工作。
2.静止培养不需增添专门设备,适合于某些原生质体培养;
振荡液体培养:
(1)连续浸没:
搅动或振动培养液使组织悬浮于培养基中。
培养液的体积约占容器体积的20%,以确保最大的气相表面,造成较好的通气条件。
(2)定期浸没:
组织块时而在液体中时而在气体里,这样既可保证培养基的充分混和,又保证了组织块呼吸所需的气体交换。
外植体的培养条件:
光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值、气体等
褐变:
是指外植体在培养过程,自身组织从表面向培养基释放出褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之变褐而死亡的现象。
褐变的原因
1.褐变与外植体组织中所含的酚类化合物和多酚氧化酶有关。
2.通常酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在,比较稳定。
3.当切割外植体后,切口附近的分隔作用破坏,酚类与多酚氧酶接触,酚类迅速氧化成褐色的醌类物质和水,
4.醌类又会在酪氨酸酶等的作用下,与体内的蛋白质发生聚合,进一步引起其他酶系统失活,从而导致代谢紊乱,生长停滞,最终衰老死亡。
防止褐变的措施:
1.温度过高或光照过强,诱导多酚氧化酶的活性提高,从而加速外植体的褐变。
2.液体培养基可有效克服外植体褐变。
在液体培养基中,外植体溢出的有毒物质可以很快扩散,因而对外植体造成的伤害较轻。
3.培养基中无机盐浓度过高,酚类物质将会大量外溢。
4.黑暗条件下,生长调节物质的存在会影响褐变。
细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成,而且还能刺激多酚氧化酶的活性。
生长素类如2,4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成,减轻褐变现象发生。
5.加抗氧化剂6.加吸附剂、活性炭6.培养基的pH值较低时,可降低多酚氧化酶活性和底物利用率,从而抑制褐变。
外植体的玻璃化:
指组培苗出现的一种生理失调或生理病变,叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、发生异常的现象。
玻璃化的危害性:
由于其组织畸形,吸收养料与光合器官功能不全,分化能力大大降低,因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料;
加上生根困难,很难移栽成活。
预防玻璃化的措施:
1)适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度
2)适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度
3)适当控制培养基中无机营养成分
4)增加自然光照,控制光照时间
5)控制好温度
6)改善培养器皿的气体交换状况
7)在培养基中添加其它物质
第五章:
愈伤组织的形成:
从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期:
起始期,分裂期,形成期。
起始期:
1.细胞准备进行分裂的时期。
2.外植体的细胞处在静止状态。
3.刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用,使外植体细胞的合成代谢活动加强,蛋白质和核酸的合成,诱导细胞开始分裂。
分裂期:
外植体细胞经过诱导以后脱分化,不断分裂增生子细胞的过程。
细胞的主要表现:
1.外层细胞在外源激素的作用下,迅速分裂,使得外层细胞数目增加,
2.细胞体积缩小,细胞的核和核仁增大到最大。
逐步回到分生组织状态。
3.随着细胞不断分裂和生长,细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加,新细胞壁合成极快。
细胞分裂快,结构疏松,缺少有组织的结构,维持其不分化的状态,颜色浅而透明。
形成期:
指在分裂期的末期,细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化,从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。
细胞特点:
1.细胞分裂部位和方向发生改变:
内部细胞发生分裂,形成像维管束或类似分生组织,组成的鸟巢状结构。
2.细胞的体积相对稳定,不再减少。
3.出现了各种类型的细胞:
如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。
4.生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色,老化的多转化为黄色或褐色。
愈伤组织生长周期:
愈伤组织生长周期为2-4周。
1.在培养基上生长一段时间以后,由于营养物质枯竭,水分散失,或有毒代谢物的积累,导致愈伤组织停止生长,甚至老化变黑、死亡。
2.转移到新鲜培养基:
定期地将它们分成小块,接种到新鲜的培养基上,可以长期保持旺盛的生长。
影响愈伤组织形成的主要因素
(1)不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。
(2)培养基种类对愈伤组织诱导的影响。
(3)外源激素对愈伤组织诱导的影响---重要因素。
(4)培养条件对愈伤组织诱导的影响:
湿度条件、温度条件、光照条件。
愈伤组织中的形态发生方式:
愈伤组织器官发生和通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株
愈伤组织器官发生:
1.先不定芽,在茎基部长根2.先长根后长芽3.在不同部位分别形成根和芽
影响愈伤组织器官发生的因素:
(1)外植体自身因素(内因)①母体植株的遗传基础②外植体的类型
(2)植物激素的作用(外因):
适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。
生长素/细胞分裂素
体细胞胚发生途径:
胚状体/体细胞胚(embryoid):
指植物细胞、组织或器官的离体培养中,起始于一个非合子细胞,并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。
体细胞胚的产生方式
1)直接在器官上发生
2)悬浮培养细胞发生途径
3)愈伤组织发生途径:
幼胚、胚和子叶
4)单细胞发生途径:
花药培养中的小孢子发育成
4)原生质体发生途径
体细胞胚状体诱导的影响因素
1)生长素
2)其他植物生长物质的作用
3)氨源形态的影响
4)其他培养条件对胚状体发生的影响
体细胞胚途径再生植物的优点:
1)数量比不定芽多
2)获得速度快
3)结构完整
4)胚状体可制成人工种子,便于运输和保存;
5)胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。
人工种子:
人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。
胚状体或芽:
有生命的物质结构。
人工胚乳:
供胚状体维持生命力。
人工种皮:
保护作用。
人工种子的优点:
1)结构完整,体积小,便于贮藏与运输,可直接播种,易于机械化操作;
2)不受季节限制,不受环境制约,胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产;
3)有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有的一些植物,也可大量繁殖无病毒材料;
4)加入抗生素、农药、菌肥等成分,提高人工种子活力和品质;
5)由无性繁殖体系产生胚,固定杂种优势。
局限性:
1.人工种皮尚不尽如人意,贮藏困难
2.生产成本高
3.流程复杂
第六章:
营养器官培养:
主要指植物根、叶、茎、花、果实等器官在离体条件下,在无菌的人工环境种做进一步培养发育,最终长成幼苗的过程。
特点:
能保持它们所具有的特征性结构,通过器官培养可快速大量地繁殖。
离体根的无性系:
由单个直根衍生,并经继代培养而保持遗传性一致的根的培养物。
根培养的意义:
v1)进行根系生理、代谢研究的最优良实验体系;
v2)研究器官分化、形态建成的良好体系;
v3)可建立快速生长的根无性系。
茎的培养分为茎尖培养和茎段培养
茎段培养:
指带有腋(侧)芽或叶柄、长数厘米的茎节段进行离体培养。
植物生长调节剂的影响
◆植物生长抑制剂三碘苯甲酸促进嫩茎增殖。
◆6-BA1-3mg/L促进茎增殖有效,浓度高会减少茎的伸长,也对下一步生根起抑制作用。
◆赤霉素抑制月季茎的增殖。
茎培养的意义:
v无性系快速繁殖;
v培养无病毒苗,品种改良;
v理论基础研究。
叶的培养:
很多植物的叶片具有很强的再生能力,由于取材方便,数量多且均一性较强,可以作为适宜的外植体。
叶培养的意义:
1)研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成的好方法
2)通过叶组织的脱分化与再分化证实叶细胞的全能性
3)通过叶组织培养,探索离体叶组织培养的条件和影响因素
4)建立体细胞快速无性繁殖体系
5)叶细胞培养物经诱变筛选突变体。
第七章
植物离体快速无性繁殖:
利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法;
所获得的株群称单株无性系或单芽无性系。
与传统无性繁殖方式的区别:
繁殖速度快,不受自然的干扰,使育苗工厂化。
植物快繁的类型与器官形成方式:
1不定芽型2器官型3器官发生型4胚状体发生型5原球茎发生型
不定芽型:
诱导顶端分生组织产生不定芽,再生成植株的方式。
1.繁殖率高
2.利用外植体原有的芽,包括隐芽在内繁殖数量大,
3.能保持物种遗传稳定性。
器官型:
从器官外植体诱导不定芽,再生成植株的方式。
遗传稳定性较好,但繁殖速度慢。
器官发生型:
从器官外植体诱导愈伤组织,经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。
器官发生型的特点:
1.繁殖速度快,2.由于经愈伤组织而再生成植株,遗传稳定性较差。
胚状体发生型:
由植物器官、组织和细胞培养而直接发生胚状体,最后以胚状体成苗的方式。
胚状体发生型的特点:
⏹遗传稳定性一致,
⏹部分植物体细胞发生数量相当大。
兰球茎型大:
部分兰花属于这一类型。
原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。
继代培养:
是初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。
继代培养过程中会产生两两种现象,即驯化现象和衰退现象
驯化(acclimation):
在开始继代培养需要加入生长调节物质,其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长的现象。
继代培养中细胞积累了较多的生长物质,因此逐渐减少对外源生长物质的需要。
衰退(recession):
长期培养的材料也会逐渐衰退,丧失形态发生能力,表现为生长不良,再生能力和增殖率下降等。
分化能力衰退的机理:
1)愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心(分生组织),当重复继代会逐渐减少或丧失,影响形成维管束,只能保持无组织的细胞团。
2)继代培养过程中,逐渐消耗了原有的与器官形成有关的特殊物质。
3)内源生长调节物质的减少或丧失。
4)细胞染色体出现畸变,数目增加或丢失。
影响继代培养的因素:
(1)植物材料的影响
(2)培养基及培养条件
(3)继代培养时间长短
(4)季节的影响
植物脱毒方法:
物理方法,化学方法,生物方法
物理方法:
(一)高温处理又称温热疗法
某些病毒受热以后不稳定,失去活性
(1)温汤浸渍处理
(2)热风处理
热处理的局限性
1.并非所有的病毒都对热处理敏感。
只对等径、线状的病毒和类菌质体起作用。
2.延长热处理时间,病毒钝化效果好,同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。
3.影响植株存活。
(二)低温处理,亦称冷疗法。
化学方法:
化学处理,又称化学疗法。
一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理,可抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成,但仍不能使病毒失活。
生物学方法:
茎尖培养
微体嫁接脱毒
愈伤组织脱毒
珠心胚培养脱毒
花药培养脱毒
为什么茎尖培养能够除去病毒?
1.病毒的移动2条途径:
2.一是通过维管系统,而分生组织中尚未形成维管系统;
二是通过胞间连丝,但这条途径病毒移动速度非常慢,赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。
微体嫁接脱毒:
小茎尖(0.14~1.0mm)嫁接到无病毒的试管实生苗砧木,培育在培养基上,可获得无病毒的幼苗
愈伤组织脱毒:
感染病毒的愈伤组织细胞并非全部含有病毒。
原因:
可能因为细胞增殖速度快过病毒复制速度,或者细胞产生变异,获得对病毒感染的抗性,最终表现出脱毒现象。
缺陷:
后代变异的几率大;
有的愈伤组织不能分化成苗。
珠心胚培养脱毒:
珠心胚:
柑橘类多胚品种中除一个受精胚以外,尚有多个由珠心细胞形成的无性胚;
珠心胚与维管束系统无联系,因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。
珠心胚大多是不育的,必须分离培养才能发育成正常的幼苗。
花药培养脱毒:
花药培养获得单倍体植物,经染色体加倍后即为无病毒植株。
脱毒植物鉴定:
鉴定原因:
1.脱毒率非常低,有时无毒株只占千分之几。
2.病毒具有延迟的恢复期,所以在最初18个月中每隔一定时间仍需进行鉴定。
鉴定方法:
直接测定法、指示植物法、抗血清鉴定法、酶联免疫吸附法、电子显微镜检查法、免疫吸附电镜法。
脱毒苗在生产中的应用:
脱毒苗用于生产可以明显提高产量和质量,一般产量可提高30%以上。
无病毒苗的长期保存:
在培养基中加生长延缓剂,低温保存,超低温保存
第八章
花粉是花粉母细胞(小孢子母细胞)经过减数分裂而形成的,因此,花粉是单倍体的生殖细胞。
单倍体细胞(haploidcell):
植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的,其染色体数目只有体细胞的一半。
花粉和花药的培养(pollenandantherculture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能,不经受精而发生细胞分裂,由单个花粉粒发育成完整植株的技术。
单倍体植物(haplobiont):
用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。
花药培养:
是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养,以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。
花粉培养:
是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。
花药制备与培养
取材要求:
小孢子发育时期在单核晚期。
注意:
1.防止损伤花药:
操作过程中注意不要损伤花药,不要直接夹花药,若受损伤,则应淘汰。
因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。
2.去掉花丝:
为了去掉体细胞
单倍体植株的二倍化:
自发加倍
优点:
不会出现核畸变,
缺点:
加倍频率极低;
人工加倍
用秋水仙碱处理单倍体可使加倍频率提高
从愈伤组织再生
把单倍体植株的茎、叶柄或根的节段,诱导形成愈伤组织,把这种愈伤组织转移到分化培养基上,在再生植株中将出现许多二倍体植株。
子房培养:
子房培养是指将子房从母体上分离出来,在无菌的人工环境条件下培养,使其生长发育形成幼苗的过程。
分为授粉子房培养和为授粉子房培养
未授粉子房
性细胞(卵细胞、助细胞、极核、反足细胞)----胚状体或愈伤组织----雌性单倍体植株
体细胞(珠被、子房壁)---胚状体或愈伤组织----二倍体植株;
受粉子房:
获得成熟果实或者具有生活力的种子
胚珠培养:
分为受精胚珠的培养和未受精胚珠培养
受精胚珠:
一是形成种子;
二是形成愈伤组织
未受精胚珠:
形成单倍体植株
子房胚珠的培养应用
1.挽救杂种胚,促进原胚继续生长,使杂种幼胚发育成熟;
2.未授粉胚珠和子房,诱导孤雌生殖,产生雌性单倍体
离体受精:
从花粉萌发到受精形成种子,从种子萌发到幼苗形成的整个过程,均在试管内完成,称为离体受精,或试管受精
子房试管受粉:
人工方法把花粉直接引入子房,使花粉粒在子房腔内萌发并完成受精过程。
精卵细胞融合法:
微电融合、高钙高PH介导融合、一般钙条件下融合、PEG诱导融合
离体受精的意义:
1.离体受精技术在克服自交不亲和性与远缘杂交障碍,特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后不能进入花柱,或在花柱中生长缓慢,使配子不能如期融合方面有着极其重要的意义。
2.另外,试管受精技术也为外源特异基因的有性转移,诱导遗传变异开辟了一条新途径
胚培养:
采用人工的
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