土壤酞酸酯污染的微生态效应和真菌植物联合修复技术研究00522Word文档格式.docx
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2.2.3酞酸酯测定15
2.2.4土壤微生物群落多样性测定17
2.3结果与分析19
2.3.1土壤中酞酸酯含量的变化19
2.3.2酞酸酯污染对土壤基础呼吸的影响19
2.3.3酞酸酯对土壤微生物多样性的影响20
2.4小结25
第三章真菌筛选及对酞酸酯的降解研究27
3.1试验材料与仪器27
3.1.1试验材料27
3.1.2试验仪器27
3.2试验方法27
3.2.1酞酸酯降解真菌的分离纯化27
3.2.2降解能力测定28
3.2.3降解条件优化28
3.2.4真菌对液体中酞酸酯的降解29
3.2.5真菌对土壤中酞酸酯的降解29
3.3结果与分析29
3.3.1降解能力测定结果29
3.3.2菌种鉴定结果30
3.3.3正交试验结果33
3.3.4F3液体培养酞酸酯降解结果33
3.3.5F3纯菌土壤酞酸酯降解结果35
3.4小结36
第四章真菌-植物联合降解研究38
4.1试验材料38
4.1.1供试土壤38
4.1.2植物比选38
4.2试验方法39
4.2.1试验准备39
4.2.2酞酸酯含量和土壤基础呼吸检测39
4.2.3土壤DGGE检测39
4.3结果与分析41
4.3.1酞酸酯对植物的影响41
4.3.2酞酸酯对土壤的影响46
4.3.3植物对酞酸酯降解的作用48
4.3.4微生物对酞酸酯降解的作用49
4.3.5真菌-植物联合修复模式初探49
4.4小结50
第五章总结与展望51
5.1酞酸酯对土壤微生态的影响研究51
5.2真菌筛选及对酞酸酯的降解研究51
5.3真菌-植物联合降解研究51
5.4论文创新点52
5.5展望52
参考文献53
致谢59
附录60
土壤酞酸酯污染的微生态效应和真菌-植物联合修复技术研究
专业:
生态学
硕士生:
郭杨
指导教师:
蔡信德研究员
摘要
本文以3种国控酞酸酯为研究对象,研究了酞酸酯复合污染的微生态效应,探讨了真菌、植物联合修复酞酸酯复合污染土壤的可行性。
研究方法及结果如下:
(1)在实验室模拟条件下,通过测定土壤基础呼吸、PAEs含量、RAPD-PCR条带数,研究了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二辛酯(DOP)3种PAEs复合污染对农田土壤基础呼吸、微生物多样性的影响。
结果表明:
PAEs污染初期的土壤基础呼吸被激活,但这种激活作用随着培养时间的延长而减弱,400mg/kg组土壤基础呼吸最高。
土著微生物对PAEs有一定的降解能力,DEP降解最快,其次为DMP,不同浓度的PAEs对微生物的降解能力有影响。
不同处理组土壤微生物群落DNA序列Shannon-Weaver指数顺序为0mg/kg>
50mg/kg>
100mg/kg>
200mg/kg>
400mg/kg。
可见,PAEs复合污染提高了土壤基础呼吸,但降低了土壤微生物多样性。
(2)采用3种PAEs复合物梯度驯化,从PAEs污染的农田土壤中筛选出土著降解真菌;
通过测定PAEs含量,研究其最佳降解条件和在液体培养基、灭菌土壤中的降解效果。
筛选出的真菌F2为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporm),F3为棒束梗霉属(Isariasp.)。
正交试验筛选出最佳试验条件为C:
N20:
1和pH7.0,同时,降解菌在pH5.0-7.0范围内均可较好的存活。
F3可在7天内将液体培养基中300mg/LPAEs降解66.20%;
30天内将灭菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.02%。
可见,所选菌株对PAEs复合污染物有较好的降解效果。
(3)采用3种PAEs复合污染土壤接种真菌后种植不同根型植物,通过测定植物株高、干重,土壤和植物PAEs含量和土壤DGGE,研究了PAEs对植物生长的影响和土壤、植物中PAEs含量的变化,探讨了建立真菌-植物联合修复模式的可行性。
PAEs对番茄、大豆的生长均有抑制作用,且对番茄的抑制作用高于大豆,但对香根草生长无影响。
添加PAEs、种植植物和接种真菌使土壤基础呼吸和真菌群落发生变化。
从DGGE图谱无法判断F3是否存在。
土壤PAEs降解是降解菌、土著微生物和植物协同作用的结果。
接种F3后可使盆栽土壤中PAEs含量较未接种组平均下降20.67%,植物中PAEs含量平均下降28.86%。
可见,接种F3后提高了土壤中复合PAEs的降解效率,同时也降低了PAEs在植物内的积累。
最后,综合试验结果提出了三种PAEs污染农田土壤的修复模式。
关键词:
土壤;
酞酸酯;
微生物;
真菌;
植物;
联合修复
Micro-ecologicalEffectsofPhthalateEsterContaminatedSoilandResearchofFungi-plantCombinedRemediation
Major:
Ecology
Name:
GuoYang
Supervisor:
CaiXinde
ABSTRACT
Theimpactsofcombinedphthalateacidester(PAE)contamination,includingdimethylphthalate(DMP),diethylphthalate(DEP),anddioctylphthalate(DOP),onsoilmicrobialdiversitywerestudied.Thefungi-plantmodeofPAEsbioremediationwasalsodiscussed.Researchmethodsandresultsareasfollows:
(1)TheimpactsofcombinedPAEscontamination,includingDMP,DEPandDOP,onfarmlandsoilbasalrespirationandmicrobialdiversitywerestudiedbymonitoringsoilrespiration,soilPAEsconcentrationandrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)markerunderlaboratorysimulationtesting.TheresultsshowedthatthesoilbasalrespirationwasactivatedbyPAEsatanearlystage,reachingamaximumvalueat400mg/kgPAEstreatment.However,thistypeofactivationeffectdecreasedwithprolongedPAEsexposuretime.Inaddition,theconcentrationofPAEsinthesoildecreased,especiallytheDEPconcentration.TheShannon-WeaverindexofsoilmicrobialcommunityDNAsequenceinalltreatmentswas:
0mg/kg>
50mg/kg>
100mg/kg>
200mg/kg>
400mg/kg.Overall,theresultsindicatedthatthecombinedPAEscontaminationinsoilmaystimulatesoilbasalrespiration,butdecreasesoilmicrobialdiversity.
(2)TwoPAEsdegradationstrainsF2andF3wereisolatedfromPAEscontaminatedfarmlandsoils,andDMP,DEPandDOPcouldbedegradedatthesametimebythosetwostrains.ThestrainswereidentifiedasFusariumoxyspormandIsariasp.respectively.TheoptimumC:
Nofthosestrainswas20:
1,andoptimumpHwas7.0.ThepH5.0-7.0wasavailablefortheirsurvival.ThebiodegradationofPAEsinliquidandsoilwerestudiedbymonitoringPAEsconcentrationandmyceliumweight.TheresultsshowedthattheconcentrationofPAEsinliquidculturemediumdecreased66.20%in7days(initialconcentrations300mg/kg).TheconcentrationofPAEsinthesoilsdecreased69.02%in30days(initialconcentrations300mg/kg).Itisclearlythat,thosetwostrainswerequalifiedforthebiodegradingofcombinedPAEscontamination.
(3)ThedegradationofPAEsinfarmlandsoilwastestedbymonitoringplantbiomassandheight,PAEsconcentrationandDGGE.Thefungi-plantmodeofPAEsbioremediationwasalsodiscussed.TheresultsshowedthatthegrowthoftomatoandsoybeanwasinhibitedbyPAEs,butnoeffectonvetiver.ThesoilbasalrespirationandfungicommunitywereinfluencebyaddingPAEs,plantsandinoculatefungi.BandsofF3werenofoundinDGGEmapsattheendofexperimentinF3inoculatesoil.SynergisticeffectonPAEsdegradationwasfoundbetweenF3,indigenousmicroorganismsandplants.Compareofnon-inoculatetreatments,theaverageconcentrationofPAEsinpotsoilwasdecreased20.67%ininoculatetreatments,andtheaverageconcentrationofPAEsinplantswasdecreased28.86%ininoculatetreatments.Itisclearlythat,inoculateF3enhancethebiodegradationofPAEsinsoil,anddeclinetheaccumulationofPAEsinplants.ThreetypesofPAEsbioremediationmodeweresuggested.
Keywords:
soil;
phthalateester;
microorganism;
fungi;
plant;
combinedremediation
第一章文献综述
1.1土壤污染概念
土壤污染是指进入土壤的污染物超过土壤的自净能力,而且对土壤、植物或环境造成损害的状况。
土壤污染物不是直接进入人体危及健康,而是通过粮食、蔬菜、水果、奶、蛋、肉等进入人体,引发各种疾病,间接地影响人体健康。
同时,土壤污染直接影响土壤生态系统的结构和功能,将对生态安全构成威胁[1]。
只有洁净的土壤才能生产出质量安全的农产品,才能保证从田头到餐桌的质量安全。
目前,我国土壤和农作物中有毒物质残留问题日趋突出,而土壤污染及其导致的环境质量恶化是农产品有毒物质残留问题的重要原因,但却最易被人们忽视。
这是因为与大气和水的污染不同,土壤污染具有隐蔽性、潜伏性和长期性,其严重后果通常只能通过对水环境质量、农产品质量,甚至通过食物链对人体健康产生危害才为人们所察觉[2]。
1.2土壤酞酸酯污染现状及危害
1.2.1土壤酞酸酯污染现状
邻苯二甲酸酯又名酞酸酯(phthalicacidesters,PAEs),是由一个刚性平面芳烃和两个可塑的非线性脂肪侧链组成,通常用酞酸酐与各种醇类之间的酯化反应获得。
PAEs呈无色油状粘稠液体,常温下蒸气压很低,难溶于水,不易挥发,其比重与水相近,难燃烧,凝固点低,易溶于有机溶剂和脂类,具有相当宽的液态温度范围和很大的流动性。
这些特殊的物理化学性质决定了PAEs的特殊环境行为[3]。
作为性能良好的增塑剂,PAEs在建材、汽车、家居、包装和医药等行业都有应用,也用作农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂、合成纤维纺织品、抛光剂等的原料。
PAEs在材料内部没有与树脂形成共价键,较易从制品向外环境转移,广泛存在于水体、土壤及空气中[4,5]。
在塑料地膜中PAEs的含量仅次于塑料本身,它们彼此之间由氢键和范德华引力结合,保留了各自相对独立的化学性质。
因此,这种材料的稳定性相对较差,PAEs易从塑料地膜中渗出,污染土壤[6]。
而塑料地膜以其质轻、透光、保温、保湿性好,不仅在我国北方广泛使用,而且在年均气温较高的南方,也被广泛应用于早稻、棉花、西瓜地覆膜育秧和冬季暖棚蔬菜生产之中。
我国地膜应用已经有20多年的时间,每年应用量近百万t,覆盖面积达1000多万hm2,覆盖作物达40多种,随着地膜老化、破碎和回收不净,农田PAEs残留日益严重。
塑料地膜技术的应用一方面极大促进了我国农业的发展,另一方面随着地膜应用量和使用年限的不断增加,大量残留地膜造成的污染也严重影响了农业生产的进行,而且对农业环境的安全与健康也构成了巨大的威胁[7-9]。
对珠三角地区的研究[10,11]表明,珠三角城市中东莞土壤中的PAEs含量最高,平均达3710μg/kg;
比居于次位的深圳高3倍;
惠州土壤的PAEs最低,为600μg/kg;
中山与惠州接近,为715μg/kg;
珠海与深圳基本含量相近,为1000μg/kg左右。
各地土壤中的PAEs均值高低顺序依次为东莞>
深圳(珠海)>
中山(惠州)。
菜园土壤中的PAEs平均含量相对比果园高37%左右,这可能由于菜园土壤使用农膜量相对果园大。
深圳菜园和果园土壤的DEP,DnP,BnBP和DEHP含量较高,在65-277μg/kg之间,其中菜园土壤的DEP含量最高。
蔡全英等[12]的研究表明,广州地区蔬菜生产基地中PAEs化合物总含量在3.00-45.67mg/kg之间,其中37%样品的PAEs化合物总含量在10-20mg/kg,22%样品的PAEs化合物总含量在20-30mg/kg,与美国PAEs控制标准相比,DMP,DEP,DnBP,BBP,DEHP均不同程度超标。
1.2.2土壤酞酸酯污染的危害
1.2.2.1酞酸酯对土壤微生物的影响
土壤微生物是土壤的重要生命体,是土壤污染的敏感指示物[13]。
当大量PAEs进入土壤环境中,土壤微生物群落的数量、结构和多样性都会受到影响,最终使土壤生态系统的功能受到损害[14-16]。
谢慧君等[14]的研究表明,土壤PAEs含量越高,对微生物代谢活性的抑制作用越大。
低浓度PAEs污染土壤中微生物以糖类和羧酸类代谢群为优势类群,而中浓度和高浓度PAEs污染土壤中微生物以多胺类代谢群为优势类群。
PAEs的投加刺激了土壤中某些特异菌种的出现,使群落遗传多样性发生变化。
陈强等[17]的研究表明,DEHP对土壤微生物有一定抑制作用,DEHP对微生物产生影响的最低可见效应浓度为10mg/kg干土。
土壤高浓度邻苯二甲酸二丁酯(DBP),邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)污染,对微生物生物量碳、土壤基础呼吸以及过氧化氢酶活性均表现抑制效应,抑制作用随处理浓度的增加而加强[18]。
DEP也可以降低土壤微生物的多样性[19],其中可培养细菌种类可降低47%,假单胞菌可降低62%,这可能是由于其亲脂性破坏了细胞膜[20]。
1.2.2.2酞酸酯对植物的影响
PAEs在植物体中有较强的富集作用,甚至在它们的深加工产品中都发现了PAEs的存在[21]。
胡萝卜、白菜、西红柿、大豆、水稻、绿豆、柽麻中都有PAEs检出[22];
在数十种柠檬油、橙子油和桔子油中也能检测出不同浓度的PAEs[23]。
王曙光等[24]的研究表明,在土壤添加100mg/kgDBP时,豇豆地上部分DBP含量可达到15mg/kg。
植物根系对DBP有较强的吸收或吸附性,根系中的DBP浓度远大于土壤施加浓度,这可能是DBP(甚至是PAEs系列化合物)对植物的危害所在。
秦华等[25]的研究表明,绿豆将DEHP向地上部转运时,主要分配在豆荚中,其在豆荚中的含量远远高于茎叶中的含量。
由于与土壤直接接触,并且是植株吸收营养的主要部分,绿豆的根系中DEHP含量普遍较高。
PAEs也在一定程度上影响作物的产量和品质。
DBP和DEHP对蔬菜幼苗期生长有一定的障碍作用,且DBP对作物生长的影响比DEHP更为突出;
2种PAEs均影响蔬菜产量,使部分品种蔬菜可食部位的Vc含量降低[21]。
DBP使蔬菜的减产幅度在12.8%-60%[26]。
虽然DBP相对易降解,但其易被富集、迁移速度较快的性质,无疑增加了其对作物造成污染的几率[24]。
土壤DBP和DEHP污染后,豇豆地上和地下部分干重均有不同程度下降,高浓度DBP和DEHP还使豇豆叶绿素a和b的含量及根瘤数降低。
随着DBP和DEHP浓度的增加,叶绿素含量逐渐下降,10mg/kg时,豇豆叶绿素a含量比空白下降8.6%,叶绿素b含量比空白下降13.3%;
50mg/kg时,豇豆叶绿素a含量下降23.5%,叶绿素b含量下降26.7%[27]。
1.2.2.3酞酸酯对动物及人的影响
现有资料显示,PAEs的急性毒性不大,Ames试验呈阴性反应,但在大剂量的情况下,对动物有致癌、致畸和致突变性[28,29]。
高丽芳等[30]用DEHP对小鼠胚胎进行试验,结果显示DEHP可导致胚胎形态发育异常,主要表现为骨骼、心血管系统、眼和神经管畸形。
大鼠试验中,雄性大鼠出现输精管萎缩退化,精细管破坏,睾丸和附睾退化,睾丸发育不全,出血性睾丸,尿道下裂等现象[31,32];
雌性大鼠出现抑止或延迟排卵,抑止雌二醇生成,多囊卵巢等现象[33]。
PAEs对动物的生化效应主要表现为过氧化酶体增生、足细胞毒性、肝脏促进作用、抗雄激素等,对啮齿类及其它动物的整体效应表现为肝癌、睾丸萎缩、尿道下裂、ER配基、细胞增生等[34]。
PAEs进入食物链后还存在生物放大现象[35]。
聂湘平[36]等报道了水中添加DMP,DEP,DBP和DEHP4种PAEs后种植龙须菜(Gracilarialemaneiformis),并用龙须菜喂养篮子鱼(Siganusoramin)的试验。
结果显示龙须菜植物对DEHP有较高的积累,篮子鱼的不同组织对4种PAEs都有一定程度的积累。
其中DBP和DEHP在鱼内脏组织中有较高的积累和分布,其次为鱼残体组织,肌肉组织中含量最低。
侧链烷基基团较长、较复杂的PAEs较侧链较短的PAEs更易在鱼体内富集。
PAEs沿龙须菜-篮子鱼食物链传递过程中存在生物放大现象。
DEHP对蚯蚓生长的可见效应浓度(LOEC)为0.005g/kg干土,蚯蚓对于0.005g/kg干土的DEHP富集倍数为7.32[17]。
对我国人群DBP暴露状况的调查[37]结果显示,DBP广泛存在于环境和人体生物样品中,估计每日总摄入量为14.8μg/(kg·
d),食物是其主要的摄入途径,占总摄入量的90.2%。
由此可以推测,人类通过皮肤、呼吸、食物链等途径长期接触环境雌激素PAEs,可对人体造成慢性危害,主要表现为生殖毒性[38,39]。
PAEs可能导致人类肢体畸形、内分泌失调、生殖系统病变,精子数量减少,乳腺癌发病率升高等不良后果,而且可以通过胎盘和授乳产生跨代影响[40]。
总之,邻苯二甲酸酯类对人类和其他生物都存在潜在危害。
1.3土壤酞酸酯污染的修复方法
1.3.1物理修复
PAEs的物理修复主要采用高比表面积的吸附剂等材料[4]。
Whittaker等[41]指出活性炭能够高效地吸附废水中的PAEs;
Wang等[42]利用细菌菌体的生物吸附去除DBP。
虽然吸附法能有效去除PAEs,但PAEs并未转化为无毒物质,对环境依然存在潜在风险。
1.3.2化学修复
PAEs的化学修复主要通过臭氧氧化和紫外光解等方法实现。
施银桃等[43]进行了水溶液中DMP的臭氧氧化研究,考察了pH值、温度、臭氧用量等对氧化结果的影响。
结果表明,臭氧氧化可降解水体中的DMP,毛细管电泳(CE)分析证明有邻苯二甲酸等中间产物产生。
臭氧氧化的效果与臭氧浓度和反应时间成正比;
DMP去除率随pH值的升高呈上升趋势;
加入催化剂Mn(Ⅱ)可大大提高DMP的去除率;
16-27℃的温度条件有利于反应进行。
刘芃岩等[44]研究了PAEs在紫外光下的降解过程,结果表明PAEs的紫外光解符合一级反应动力学,反应速率常数随PAEs浓度的增大而增大。
PAEs的降解从侧链开始,光照产生的羟基自由基攻击苯环和侧链酯基相连的C—C键,随着C—C键的断裂,PAEs被逐步分解为小分子,主要的中间产物为苯甲酸单酯。
UV/H2O2联用工艺对水中DMP的去除效果较好。
DMP的去除效率随H2O2投加量的增大而增大,但H2O2
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