学年浙科版选修1 第一章 大肠杆菌的培养和分离 学案.docx
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学年浙科版选修1第一章大肠杆菌的培养和分离学案
实验一大肠杆菌的培养和分离
1.培养基中需含有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质。
2..本实验用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌,用LB固体培养基分离大肠杆菌。
3.消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物;而灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。
4..实验室常用煮沸消毒法、紫外线或化学药剂进行消毒;常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌及过滤灭菌等。
5.固体培养基的配制过程为:
计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板。
6.微生物分离接种最常用的方法是划线分离法和涂布分离法。
一、微生物
1.概念:
微生物是结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。
2.利用:
生产抗生素,制作发酵食品,治理环境污染等。
二、培养基
1.概念
人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出的供其生长繁殖的营养基质。
2.营养构成
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐及生长因子,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
3.培养基的类型
(1)按物理性质分:
固体培养基、半固体培养基、液体培养基。
(2)按目的用途分:
鉴别培养基、选择培养基。
4.微生物生长对特殊营养物质的要求
(1)细菌培养基要用蛋白胨和酵母菌提取物来配置,细菌喜荤。
(2)霉菌培养基一般用无机物配制或加蔗糖的豆芽汁即可,霉菌喜素。
5.微生物生长对pH的要求
细菌要求在中性偏碱(6.5~7.5)的环境中生长;真菌要求在中性偏酸(5.0~6.0)的环境中生长。
三、无菌技术
1.获取纯净培养物的方法
获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵,具体操作如下:
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2.消毒和灭菌
(1)概念:
[填表]
项目
方法
结果
常用的方法
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子
灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、过滤灭菌
(2)常用方法:
[连线]
四、分离细菌的两种方法比较
项目
划线分离法
涂布分离法
工具
接种环
玻璃刮刀
原理
划线过程中接种环上的菌液逐渐减少,到划线最后部分细菌间距离加大,经培养后能得到单菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。
在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落
特点
方法简单,但单菌落较难分开
单菌落更易分开,但操作复杂些
目的
使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
五、大肠杆菌的培养与分离
1.大肠杆菌
(1)特性:
革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
(2)繁殖:
以分裂的方式繁殖,分裂速度很快。
2.扩大培养与分离
扩大培养用LB液体培养基,划线分离用LB固体平面培养基。
3.大肠杆菌分离过程
(1)培养基灭菌:
50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基及培养皿使用高压蒸汽灭菌。
(2)倒平板:
将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中,水平放置,使之形成平面。
(3)接种:
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌,在每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
(4)划线分离:
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次,在固体培养基的平板上连续划线,盖好培养皿。
培养皿倒置(盖在下面),放在37℃恒温培养箱中培养12~24h后,可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。
(5)培养观察:
在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在空白斜面上,在37℃下培养24h后,置于4℃冰箱中保存。
1.下列操作错误的是( )
A.用酒精擦拭双手
B.用氯气消毒水源
C.实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.玻璃器皿(吸管、培养皿)用酒精擦拭灭菌
解析:
选D 对玻璃器皿一般应进行干热灭菌,而不是用酒精擦拭消毒。
2.下列有关涂布分离法的叙述,错误的是( )
A.首先将菌悬液进行一系列的梯度稀释
B.将不同稀释度的菌悬液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C.在适宜条件下培养
D.都可在培养基表面形成单个的菌落
解析:
选D 涂布分离法是将菌悬液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌悬液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,在适宜条件下培养。
只有在稀释度足够高的菌悬液里,聚集在一起的微生物才能被分散成单个细菌,从而在培养基表面形成单个的菌落。
3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?
提示:
恒温培养时,培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发,倒放培养皿则会使水蒸气凝结成的水滴在培养基表面更好地挥发;如果正放,则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。
如果培养皿中已形成菌落,则会导致菌随水扩散,很难再分成单菌落,达不到分离目的。
4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?
提示:
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤(特别是培养基);使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。
1.LB培养基的分类及用途
2.几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类
主要方法
应用范围
灼烧灭菌
酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具,如接种环、接种针或其他金属用具等,接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌
干热灭菌箱在160~170℃加热1~2h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽灭菌
100kPa、121℃维持15~30min
培养基及多种器材、物品
玻璃砂漏斗过滤灭菌
玻璃砂漏斗过滤
含尿素或葡萄糖的培养基的灭菌
煮沸消毒法
100℃煮沸5~6min
家庭餐具等生活用品的消毒
紫外线消毒
30W紫外灯照射30min
接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒
用体积分数为70%~75%的酒精、碘酒涂抹,来苏尔喷洒等
用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
3.倒平板操作的注意事项
(1)打开紫外灯和过滤风,待LB固体培养基冷却到60℃左右。
(2)关闭紫外灯,点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭桌面及双手。
(3)在火焰旁右手3指拿锥形瓶,2指拿封口膜。
(4)使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。
(5)左手将培养皿打开一条缝隙,右手将培养基倒入培养皿,立刻盖上皿盖。
(6)待平板冷却凝固后,将平板倒过来放置。
[题组冲关]
1.大肠杆菌的培养和分离所用的培养基从物理性质上分别属于( )
A.液体培养基、固体培养基
B.固体培养基、液体培养基
C.液体培养基、液体培养基
D.固体培养基、固体培养基
解析:
选A 培养基从物理性质上可分为固体、半固体和液体培养基。
大肠杆菌的分离和培养分别用固体和液体培养基。
2.下列对灭菌和消毒的理解,错误的是( )
A.灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B.消毒和灭菌实质上是完全相同的
C.接种环用灼烧法灭菌
D.常用灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法
解析:
选B 消毒是使用较为温和的物理或化学方法,仅杀死物体表面或内部一部分微生物,不包括芽孢和孢子。
灭菌则是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。
3.下列有关倒平板操作的叙述,错误的是( )
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.将培养皿打开,培养皿盖倒放在桌面上
D.平板冷却凝固后需要倒过来放置
解析:
选C 整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵,因此灭过菌的培养皿应放在火焰旁,打开的锥形瓶瓶口应迅速通过火焰,培养皿应打开一条稍大于瓶口的缝隙,而不能将培养皿盖完全打开,平板冷却凝固后需要倒过来放置。
4.请回答下列与大肠杆菌有关的问题:
(1)从生态系统的成分上看,大肠杆菌属于________。
(2)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
显色剂
琼脂
含量
10.0g
5.0g
5.0g
2.0g
0.2g
12.0g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000mL
该培养基属于__________(填“固体”或“液体”)培养基。
该培养基中的碳源是____________________。
(3)在微生物培养操作过程中,为防止杂菌污染,需对培养基和培养皿进行____________(填“消毒”或“灭菌”);操作者的双手需要进行清洗和__________。
空气中的细菌可用紫外线杀灭,其原因是紫外线能使蛋白质变性,还能____________________。
(4)将配制好的培养基分装到试管中,加棉塞后若干支试管一捆,包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入______________中灭菌,温度为________,时间为__________。
灭菌完毕拔掉电源,待锅内压力自然降到大气压时,将试管取出。
如果棉塞上沾有培养基,此试管应____________。
(5)使用高压蒸汽灭菌锅时注意,先向锅内倒入________。
把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。
若在灭菌前,没有排尽锅内的冷空气会导致________________________________________________________________________。
(6)从一支试管向另一支试管接种时注意,接种环要在酒精灯________(填“内焰”或“外焰”)灭菌,并且待接种环______后蘸取菌种,试管口不能离开酒精灯火
焰附近,将接种的试管在适宜温度下培养,长成菌落后放入______冰箱中保存。
解析:
(1)大肠杆菌营腐生生活,从生态系统的成分来看,大肠杆菌属于分解者。
(2)表中的培养基配方中含有琼脂,是固体培养基,其中能为大肠杆菌提供碳元素的物质有蛋白胨、乳糖和蔗糖。
(3)微生物培养过程中,培养基和培养皿要进行灭菌,操作者的双手要进行清洗和消毒;紫外线杀菌的原理是紫外线不仅能使蛋白质变性,还能损伤DNA的结构。
(4)培养基及器材、物品的灭菌应用高压蒸汽灭菌锅,在压力为100kPa、温度为121℃条件下,灭菌15~30min。
若棉塞上沾有培养基,易被杂菌污染,应废弃。
(5)使用高压蒸汽灭菌锅时要先加入适量水,否则没有高压蒸汽,还有可能损坏设备。
(6)酒精灯外焰温度高,灭菌效果好。
灼烧后待冷却后再蘸取菌种,否则会杀死菌种造成实验失败。
答案:
(1)分解者
(2)固体 乳糖、蔗糖、蛋白胨 (3)灭菌 消毒 损伤DNA的结构 (4)高压蒸汽灭菌锅 121℃ 15~30min 废弃 (5)适量水 锅内温度上升不到应有度数,使灭菌不彻底 (6)外焰 冷却 4℃
1.平板划线法的操作步骤
2.涂布平板法的操作步骤
(1)操作图示:
(2)相关说明:
①将分别盛有9mL水的6支试管灭菌,并按101~106的顺序编号。
②用移液管吸取1mL培养的菌液,注入101倍稀释的试管中。
用手指轻压移液管上的橡皮头,吹吸3次,使菌液与水充分混匀。
③从101倍稀释的试管中吸取1mL稀
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