不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较 学号Word格式.docx

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methodsfromdifferentsoils

Abstract

TheextractionandpurificationofDNAfromenvironmentalsamplesisnotonlyaprerequisiteformicrobialresearch,andisoneoftheenvironmentalmetagenomicsmostcriticaltechnicalissues,theyieldandpurityofDNAonthesubsequentseriesofmolecularbiologytechniquesoperatesuchas:

polymerasechainreaction（PCR）amplification,restrictionenzymedigestion,thenucleicacidhybridization,etc.willhaveahugeimpact,iffollow-uptestseffectively,youmustfirstobtainacertainpurity,quantity,betterDNAfragmentsrepresentativeandappropriatelength.Inthispaper,wehavecomparedseveraldifferentmethodsofDNAextractionandpurificationforthreedifferentsoil,loam,sandyclay.AfteraNanoDropspectrophotometerandbyagarosegelelectrophoresisandpurifiedfromtheextractofthesoilofthreeDNAconcentrationandpurity,andtheresultsshowedthat:

PowerSoil®

DNAextractionkitandphenol-chloroformextractionandisopropanolprecipitationpurificationmethods'

combinedprovidestherightDNAforthestudyofenvironmentalgroupsmetagenomicsequencing.

Keywords:

Microbialsoil,DNA,Extraction,Purification

目录

1.绪论1

1.1研究背景1

1.2国内外研究进展2

1.3本文研究意义4

2.DNA的提取方法和纯化方法5

2.1土壤样品5

2.2DNA提取方法的比较5

2.2.1原位裂解法5

2.2.2PowerSoil®

DNA提取试剂盒（MoBio）6

2.2.3Meta-G-NomeDNA提取试剂盒（Illumina）7

2.3DNA纯化方法的比较7

2.3.1QIAEXIIGel纯化试剂盒8

2.3.2PowerCleanDNAClean-UpKit（MoBio）8

2.3.3TheAgencourtAMPureXPPCRPurificationsystem9

2.3.4苯酚/氯仿抽提和异丙醇沉淀9

2.4DNA纯度与浓度的检测10

3.结果与讨论11

3.1DNA提取方法的比较结果11

3.2DNA纯化方法的比较结果11

结论14

致谢15

参考文献16

1.绪论

1.1研究背景

土壤微生物主要包括细菌、真菌、放线菌和藻类，是土壤生态系统的重要组成部分。

土壤微生物不仅是生态系统的分解者，而且还是生态系统中养分的巨大来源，担负着分解动物、植物残体的重要责任，推动着生态系统的物质循环和能量流动，维持着生态系统的稳定性，它们在整个生态系统中扮演着非常重要的角色。

在传统的微生物学中，微生物的分离和培养是研究利用微生物的第一步。

但是，由于土壤环境的复杂性和培养条件的限制，如含有大量的化学无机物或者有机物，存在着对某些酶反应的抑制剂，如腐殖酸或腐殖酸的类似物，重金属离子，酚类化合物等等。

一般认为，能用现有的技术培养的微生物仅仅占微生物总的种类数的1%左右，而不能培养的微生物才是环境微生物多样性的主体[1-3]。

随着分子生物学的发展，研究方法和手段不断更新，土壤微生物的研究掀开了崭新的一页。

微生物的基因组序列测定工作大规模展开和功能基因组学和生物信息学迅速发展，人们现在可以绕过微生物菌种分离培养这一步骤，直接在基因水平上研究和开发未培养微生物资源。

宏基因组学这个概念是在1998年首先由Handelsman等提出的，它的定义是“利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的微生物群落，而不需要经过分离、培养单一种类的微生物”[4-5]。

现代基因工程新的研究热点和发展方向就是构建微生物的宏基因组文库并且筛选其生物活性物质。

而用适当的方法从土壤中提取并且纯化DNA，是从分子生物学的角度对土壤微生物进行研究的前提条件。

后续一系列的分子生物学技术操作如：

多聚酶链反应（PCR）扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都需要先获得一定纯度、数量、较好代表性和适当片段长度的DNA[6]。

DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，由于土壤成分复杂不同，土壤样品之间差异较大，微生物仅是其中极少的一部分，加之，微生物细胞通常都紧密的吸附在颗粒表面。

所以，从土壤样品中高效地获得DNA具有很大的难度。

另外，土壤中通常含有大量影响对DNA进行分子操作的物质，因此，有效地纯化DNA也较为困难。

再加上，由于对一些极端环境中的微生物的宏基因组的研究有望得到一些特殊的应用，这更对DNA的提取和纯化技术提出了挑战。

1.2国内外研究进展

土壤DNA提取和纯化的方法有很多，而关于土壤DNA的提取方法，基本可以分为两类，一类是直接提取法，另一类是间接提取法。

直接提取法是采用原位裂解土壤微生物的方法，这种方法所获得的基因组DNA都是粗提取液，含有很多杂质，如黄酸、腐殖酸等等，会抑制下游的实验，因此，人们又尝试许多方法来去除腐殖酸的影响，其中Tiedje等人试验用PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）和CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去除腐殖酸，获得了较好的效果[7]。

由于土壤样品中一些含钙的物质具有极强的黏附DNA的能力，DNA经释放后很容易又被吸附到基质中。

因此，对样品而言，细胞破壁是尤为重要的。

不同的细胞裂解方法使提取的DNA质量有很大的差异，主要包括：

物理法，如：

液氮研磨法、珠磨匀浆法、超声波法、煮沸法和冻融法等；

化学法，如：

盐类法、表面活性剂（SDS）法和有机溶剂法等；

酶解法，如裂解酶法、蛋白酶K法和溶菌酶法等。

各种裂解方法都有优势与不足，由于研究者的样品和所采用的方法不同，得出的结果也不完全相同[8]。

物理法：

Guthrie等认为液氮研磨法可将嵌在沉积物中的细菌细胞暴露出来，并且液氮还有可能改变细菌周围粘土的结构[9]。

宫强等比较了酚/氯仿抽屉法、改良CTAB法、CTAB法和液氮研磨法等DNA提取方法，发现采用液氮研磨法提取的DNA纯度高、数量多，核酸的降解少，避免了DNA的断裂，可以提供足量、可信的模板[10]。

Cullen等认为珠磨匀浆法比化学法和冻融法都更有利于细胞的破裂，但是提取的DNA很容易被剪切，可能会包含一些小片段[11]。

郑雪松等发现采用珠磨匀浆法得到的DNA产量最低，并且含有大量的蛋白质和酚类杂质[12]。

孙晓棠等采用珠磨匀浆法从土壤中提取的DNA经过纯化后可以用于PCR[13]。

其中液氮研磨法是最简单的破壁方法，并且破壁的效果较好。

其他一些物理破碎方法，如超声波法、微波热激法等，也被广泛采用。

Frostegardetal.发现，在研磨之前，冻干土样，能极大的提高裂解效率。

通常，物理法对超微细胞，营养菌丝体和一些孢子有很好的裂解效果，但经常会导致DNA的严重剪切[14]。

化学法：

Guthrie等认为DNA能被沉积物中的含钙物质紧紧吸附，通过加入EDTA可抑制DNA的吸附，通过螯合去除重金属离子[9]。

郑雪松等比较了酶解法、化学法、物理法对活性污泥总DNA提取效率的影响，认为化学法的破壁效果最好，获得的DNA较多，但是含有很多杂质，纯度也不高[12]。

在比较DNA提取方法的实验中，Milleretal.发现，Chelex一100的使用，对DNA产量的减少起着决定性影响[15]。

Selenska&

Klingmuller报道了一种快速提取土壤DNA的方法—让土壤泥浆在70℃，SDS一磷酸钠缓冲液中温和的振荡，用这种温和的方法获得的DNA片段平均大小在25kPb左右[16]。

酶解法：

孙栋等发现在提取土壤微生物DNA时，蛋白酶K法比溶菌酶法的效果更好，能使DNA大片段总得率提高20%以上[17]。

间接提取法则是由Faegrietal.和Torsvik&

Goksory首先报道的，主要包括以下几步：

（1）悬浮土壤颗粒；

（2）通过离心把土壤颗粒与微生物细胞分开；

（3）裂解分离出微生物细胞；

（4）分离核酸[18]。

因为有很多微生物分布于土壤团粒的深处，而且与土壤颗粒紧密结合，所以有很多方法是用来悬浮土壤颗粒的。

阳离子交换树脂Chelex-100被认为是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。

Bakken[19]发现，用六偏磷酸盐与双蒸水来悬浮土壤颗粒，没有显著的差别。

Faegrietal.首先提出了根据沉降速度的不同把悬浮起来的土壤颗粒跟细胞分开的方法[18]。

Holbenetal.认为，多轮的悬浮细胞与收集细胞，能大大提高细胞的回收率[20]。

但是，这种方法需要专门的仪器，并且操作耗时较多，步骤繁琐，也很容易造成物种的丢失。

所以针对这些土壤中微生物DNA提取的难点，一些生物公司研发出了提取DNA的商业试剂盒，如MoBioUltracleanSoilDNAKit（MoBIOLaboratories，Inc.，SolanaBeach，calif.），Bio101FastDNASPINKit（Forsoil）（Biol01，Lajolla，Calif）.

关于土壤DNA纯化的方法却是多种多样的，主要包括:

CsCl密度梯度超速离心、透析、电泳、层析等.Romanowsky等，用透析来纯化从土壤中提取的DNA并扩增细菌DNA[21-22]。

Porteous等，连续使用CTAB、PEG和微量浓缩器（保留大于125bp的DNA）来纯化它们的粗提物，这种快速方法纯化的DNA能成功地进行PCR扩增和酶的消化[23]。

Jackson等人研究发现交联葡聚糖旋转柱，特别是G50型柱子对于纯化来自于森林或碳水化合物污染的土壤的DNA样品是无效的[24]。

Zhou等比较了4种DNA的纯化方法（单次管纯化法、双次管纯化法、凝胶加离心收集法、凝胶加单次管纯化法），发现凝胶加离心收集法的DNA得率最高，但是凝胶电泳的回收率随着DNA片段分布的不同而变化，除此之外，DNA在纯化的过程中会发生损失，粗提的DNA中含有的腐殖酸等杂质会干扰DNA结合到树脂上[25]。

邵继海等比较了4种DNA的纯化方法（1%（质量分数，下同）的琼脂糖凝胶电泳纯化法、葡聚糖凝胶G2200离心层析和1%的琼脂糖凝胶电泳结合纯化法、葡聚糖凝胶G2200离心层析纯化法、含2%（质量分数，下同）PVP的1%琼脂糖凝胶电泳纯化法），研究发现，葡聚糖凝胶G2200离心层析和1%的琼脂糖凝胶电泳结合纯化法处理的PCR产物最多，但是都不能完全纯化从土壤中抽提的DNA[26]。

还值得一提的就是Jacobsen用具选择性的磁性捕获钳杂交（magneticcapturehybridization，MCH）方法成功的去除了腐殖酸对PCR的抑制，MCH可将靶DNA和其它DNA及腐殖酸等分开[27]。

Chandler等用肽核酸（peptidenucleicacid，PNA）钳和寡聚物作为特异探针对亲合磁性捕获方法进行了类似研究，该方法在研究极少量土样或低生物量土样中的靶DNA时具有很大的优势[28]。

1.3本文研究意义

环境宏基因组学的研究开发的思路是：

从土壤中直接分离出大片段的DNA，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库。

获得的克隆可根据宿主细菌获得的功能来进行筛选，也可以用已知探针来分离目的基因片段，加上表达调控元件后，使目的基因表达，从而获得产物。

因为土壤样品中DNA的提取和纯化是建立环境宏基因组文库的最关键、最重要的一步，其不仅要尽可能的将环境中所有微生物的DNA提取出来，还要保证一定的DNA片段长度和完整性，这直接关系到文库所反映信息的全面性，另外，土壤样品中都含有一定的杂质，如土壤中的腐殖酸类物质，这些物质可以抑制分子克隆中多种酶的活性，因此必须将其去除。

所以，DNA提取方法的选择是非常重要的，不同土样、不同的提取方法所提DNA的量和片段的大小及其完整性都有很大的不同。

而且DNA的纯化质量会显著影响建库的效果。

同时，严重影响着常规分子克隆中酶切、酶连、转化等的操作过程。

所以，提取和纯化土壤DNA的难度很大。

　本文在参考了大量文献后选取了三种DNA提取方法和四种DNA纯化方法进行的比较，用其中最优的方法分别对三种典型土壤类型，粘土、沙土、壤土进行DNA的提取和纯化，以此建立一种快速，有效的适合土壤宏基因组研究的DNA提取和纯化方法。

2.DNA的提取方法和纯化方法

2.1土壤样品

本实验选取了三种典型的土壤作为环境样品：

壤土（Lome）、粘土（Clay）和沙土（Sand）。

其中壤土的pH值呈酸性，pH值=3-4，并且金属含量很高，粘土和沙土的pH值呈中性，pH值=6-7，而且它们含有很低的生物量。

（图2.1）

Figure2.1ThreetypesofsoilsusedinDNAextractionmethods

2.2DNA提取方法的比较

2.2.1原位裂解法

直接提取法，就是在土壤样品中原位裂解微生物的细胞，以释放出DNA，进行提取的方法。

这一方法应用得最为广泛，因为它能够比较完整的裂解土壤中绝大多数微生物的细胞，并在可接受的DNA提取时间之内，能最大限度的获得高产量的DNA。

操作步骤：

在无菌操作台上，称取每种土壤样品各5g（湿重），分别放在50mL无菌离心管中，每个管中加入13.5mLDNA提取缓冲液（100mmol/LTris－HCl[pH=8.0]，100mmol/LsodiumEDTA[pH=8.0]，100mmol/Lsodiumphosphate[pH8.0]，1.5mol/LNaCl，1%CTAB，2%PVPP），剧烈漩涡5～10min，使土壤颗粒充分分散在缓冲液中。

将上述样品置于37℃，225r/m，水平振摇45min，使土壤匀质化。

每管加入20%的SDS1.5mL，上下颠倒、混匀，65℃水浴3h，其间尽可能的温和颠倒混匀。

水浴裂解的过程结束后，立即加入预冷的氯仿/异戊醇（体积比为24∶1），上下颠倒，充分混匀后，在室温下，离心15min（8216r/m）。

收集上清液，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，在室温下，沉淀1h后，离心20min（10000r/m），收集沉淀。

核酸沉淀用70%的冰乙醇洗涤2次，重置于100μL无菌的TE缓冲液中（10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH=8.0）。

DNA提取试剂盒（MoBio）

PowerSoil®

DNA提取试剂盒比UltraClean®

SoilDNA提取试剂盒多了腐殖质（棕色）的去除过程。

这种处理方法可以有效的去除所有类型的土壤中的PCR抑制因子。

可以用来提取所有类型土壤样品的高质量的DNA，包括富含腐植酸的各种难提的土样样品。

所提取出来的高质量DNA可以直接进行PCR扩增。

加样量：

此试剂盒的设计加样量是0.25g。

不同土样类型加样量请参照下表1.1：

表1.1PowerSoil®

DNA提取试剂盒的设计加样量

土壤类型

建议最大加样量（g）

壤土Lome

0.25

粘土Clay

沙土Sand

0.5

分别取0.25g土壤样品到PowerBeadTubes中Tubes中已经含有缓冲液；

轻轻涡旋混匀；

加入60μlSolutionC1，上下颠倒数次混匀；

把PowerBeadTubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速（3200r/m，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min）涡旋连续振荡10min；

室温10000g离心30s；

转移上清液至一个干净的2mLCollectionTube中；

加入250μlSolutionC2到上清中，涡旋混匀5s。

4℃培养5min；

室温10000g离心1min；

避开沉淀小珠，转移上清液≤600μl到一个新的收集管中；

加入200μlSolutionC3到上清中，涡旋混匀。

避开沉淀小珠，转移上清液≤750μl到一个新的收集管中；

加入1200μlSolutionC4到上清中，涡旋混匀5s；

加入约675μl上清液到SpinFilter中，室温10000g离心1min。

弃去滤液，继续加入约675μl上清，室温10000g离心1min。

重复直到过滤完所有上清液；

加入500μlSolutionC5到SpinFilter中，室温10000g离心30s；

弃去上清液；

小心转移Spinfilter到2mLCollectionTube中，尽量避免SolutionC5污染；

加入100μlSolutionC6到白色滤膜中心；

弃去SpinFilter。

此时收集管中的DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化。

2.2.3Meta-G-NomeDNA提取试剂盒（Illumina）

Meta-G-NomeDNA提取试剂盒是用来从水体，土壤，或堆肥样品中的不可培养或难以培养的微生物上提取DNA，而且不需要使用试剂。

该试剂盒提取高分子量DNA，是随机剪切的（带片段大小约40kb），对尺寸的选择没有要求，并且可以直接用于最终修复和建造的文库，PCR扩增，或下一代的测序。

实验前，加入Tween20到提取缓冲液中（每毫升提取缓冲液加1ulTween20），以获得0.1％Tween20的最终浓度，加入1g湿土壤到50mL的螺旋盖锥形管中，并加入10mL含Tween20提取缓冲液；

最大速度，涡旋1min，；

用台式离心机在1600g下离心土壤悬浮液4min，倒出上清于新的50mL的试管中；

每次提取都加入20mL含有Tween20的剩余提取缓冲液到土壤颗粒中，并以最大速度涡旋1min；

土壤悬浮液在900g离心3min；

重复以上两步再次重新提取土壤颗粒；

合并的上清液在900g离心2min，将上清转移到一个新的50mL试管后倒入1.2μm微孔滤膜预过滤材料中过滤，收集滤液；

再使用0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液；

取出膜，切膜成两半，并把每个半圆分别放置在50mL的无菌锥形管内，不要让滤膜变干；

加入1.5ulTween20到1.5mL过滤洗涤缓冲液中，加入1.5mL含有0.1％Tween20的过滤洗涤缓冲液到上管中；

低速涡旋该管，复位滤膜，再设置最高速度涡旋1-2min，洗去滤膜上的微生物；

细胞悬液转移到干净的微量离心管中，14000g离心2min，以沉淀细胞，丢弃上清；

重悬细胞沉淀中加入300μlTE缓冲液中，再加入2ul裂解溶菌酶溶液和1μl核糖核酸酶A的细胞悬液，混匀，短暂离心，；

在37℃培养30min；

添加300ul的Meta裂解液（2X）和1μl蛋白酶K至管，最大速度涡旋；

短暂离心；

在65℃下培养15min，冷却至室温，然后放置在冰上3-5min；

添加350ul的MPC蛋白质沉淀试剂至管，高速旋涡10s；

在微型离心机中以20000g或最大速度离心10min，沉淀碎片，将上清转至干净的1.7mL离心管中，弃沉淀；

异丙醇沉淀，乙醇洗涤脱盐：

干燥空气中沉淀8min；

在40ul的TE缓冲液中重悬DNA沉淀；

得到的DNA可用于后续的PCR或随后的宏基因组测序中。

2.3DNA纯化方法的比较

不管是直接提取法还是间接提取法，所获得的DNA粗提液中仍然含有大量的污染物，这些污染物对后续的PCR扩增、分子杂交、限制性物理图谱分析、克隆等分子操作都会产生非常严重的影响。

在这些污染物中，腐殖酸和酚类化合物产生的负面影响是最为严重的，它们也是最难去除的。

经研究表明，腐殖酸与核酸有着相似的物理化学性质，所以在纯化过程中二者会竞争纯化柱上的吸附位点，残留的腐殖酸会降低DNA的杂交效率，会抑制某些DNA限制性内切酶的活性，它还可以通过鳌合镁离子，抑制PCR反应的活性等等，所以对DNA的纯化非常重要。

2.3.1QIAEXIIGel纯化试剂盒

QIAEXIIGel纯化试剂盒应用硅颗粒纯化DNA片段，回收率可以达到60–95%。

试剂盒提供了硅胶颗粒悬浮液，在离液盐存在的条件下，DNA片段结合到硅胶颗粒上。

把QIAEX 

IISuspension添加到溶液或溶解的琼脂糖凝胶中，使之结合DNA。

通过简单的离心操作收集硅胶颗粒，洗涤后，用Tris缓冲液或纯水洗脱得到40 

bp–50 

kb的DNA[29]。

该试剂盒从TAE或TBE琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中高效回收40bp-50kb的DNA并且，没有NaI，避免了干扰后续反应