生物分离工程实验讲义生工09Word格式.docx
- 文档编号:22527005
- 上传时间:2023-02-04
- 格式:DOCX
- 页数:15
- 大小:59.35KB
生物分离工程实验讲义生工09Word格式.docx
《生物分离工程实验讲义生工09Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生物分离工程实验讲义生工09Word格式.docx(15页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
一份沉淀用于“除杂”步骤,另一份沉淀用0.1MNaOH溶液溶解并定容至100mL,用于“酪蛋白含量测定”步骤。
2、除杂
将上述沉淀捣碎,加入10mL95%乙醇,搅拌制成悬浮液。
将此悬浮液倾于布氏漏斗中,抽滤除去乙醇溶液,再用10mL乙醚-乙醇混合液(1∶1)洗涤沉淀两次,最后再用10mL乙醚洗涤沉淀两次,抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去,在表面皿上摊开挥干乙醚后,置烘箱中80℃干燥过夜,称重(m1)。
3、酪蛋白含量测定
(1)标准曲线的绘制
分别移取酪蛋白标准液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL于干燥试管中,不足1.0mL者用0.1MNaOH溶液补足1.0mL,然后分别加入4.0mL双缩脲试剂,混匀,室温下反应30min,测定540nm波长处吸光度。
以酪蛋白质量(mg)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(2)酪蛋白含量测定
取“步骤1”中样品溶液1.0mL,加入4.0mL双缩脲试剂,混匀,室温下反应30min,测定540nm波长处吸光度,查标准曲线,求得酪蛋白质量。
平行测定3次,求其平均值,并计算25mL牛乳中酪蛋白的质量(m2)。
五、结果与讨论
1、牛乳中酪蛋白含量的计算
含量(g/mL)=
2、酪蛋白提取得率的计算
得率(%)=
六、思考题
1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃?
2、除杂时,能否将三种溶剂的顺序颠倒?
为什么?
3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么?
4、比较牛乳中酪蛋白测定含量与理论含量大小,并对测定结果进行讨论。
实验二大蒜细胞SOD酶的提取与分离
1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤;
2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数:
回收率和纯化倍数。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种就有抗氧化,抗衰老,抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子(O-)进行歧化反应,生成氧和过氧化氢:
2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组合组织或者细胞破碎后,可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。
由于SOD不溶于丙酮中,可用丙酮将其沉淀析出。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间,生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅,即酶活力越大,颜色越浅。
三、试剂和材料
新鲜蒜瓣,市售
磷酸缓冲液:
0.05mol/L,pH7.8
氯仿一乙醇混合溶剂:
氯仿﹕无水乙醇=3﹕5(V/V)
丙酮:
用前冷却至4~10℃
0.1mol/LTris—HCl缓冲液(pH=8.2,内含2mmol/LEDTA)
10mmol/LHCl
45mmol/L邻苯三酚(内含10mmol/LHCl)
四、实验步骤
1、组织或细胞破碎
称取5g左右大蒜蒜瓣,置于研钵中研磨,使组织或细胞破碎。
2、SOD的提取
将上述破碎的组织或细胞,加入2~3倍体积(10-15mL)的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液,继续研磨搅拌20min,使SOD充分溶解到缓冲液中,然后在5000r/min下,离心15min,收集上清液得提取液。
留出1mL备用,剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。
3、除杂蛋白
提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min,5000r/min离心15min,去杂蛋白沉淀,收集上清液得粗酶液。
留出1mL备用,剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。
4、SOD的沉淀分离
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,5000r/min离心15min,得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于少量(5ml)0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中,再加水5mL,5000r/min离心15min,收集上清液,得SOD酶液。
准确量取体积。
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样,测定各自的SOD活力和蛋白浓度。
5、SOD活力测定
参照李建武的《生物化学实验原理和方法》,采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。
邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用,在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基,反应开始后溶液逐渐变成黄色,在有超氧化物歧化酶存在时,由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,降低了自氧化速率。
中间产物在325nm时有强力的光吸收,采用分光光度计即可检测。
(1)邻苯三酚自氧化速率的测定:
在试管中按表1加入各试剂,加入邻苯三酚后马上计时,迅速摇匀倒入石英比色皿中,在325nm波长下,从第1分钟开始,每隔30秒测一次光吸光度,测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标,反应时间(min)为横坐标绘制反应曲线,计算邻苯三酚自氧化速率k0(直线斜率)。
表1邻苯三酚自氧化测定加样表
试剂
加样量(mL)
校零管
测定管
0.1mol/LTris—HCl缓冲液(pH=8.2,内含2mmol/LEDTA)
4.5
蒸馏水
4.4
10mmol/LHCl
0.1
——
45mmol/L邻苯三酚(内含10mmol/LHCl)
总体积
9.0
(2)SOD酶活的测定:
在试管中按表2加入各试剂,加入邻苯三酚后马上计时,迅速摇匀倒入石英比色皿中,在325nm波长下,从第1分钟开始,每隔30秒测一次光吸光度,测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标,反应时间(min)为横坐标绘制反应曲线,计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1(直线斜率)。
表2SOD酶活测定加样表
4.3
待测样
(3)酶活力测定
酶活性单位定义为:
在lml的反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。
按下式计算样品中SOD酶单位活力:
单位体积活力(U/ml)=
总活力(U)=
式中:
反应液总体积=9mL;
样品液稀释倍数=1;
加入样品液体积=0.1mL;
活性单位定义体积=1mLl;
样品液总体积=实验中各样品实测体积。
6、样品中可溶性蛋白含量的测定
从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2mL、0.4mL、0.5mL,按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释,分别测定稀释液在260nm和280nm波长处的吸光值,按下式计算可溶性蛋白的含量:
蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280–0.74A260)×
稀释倍数
总蛋白(mg)=蛋白质浓度×
样品液总体积
将试验结果及相应的计算结果填入下表:
体积
(mL)
单位活力
(U/mL)
总活力
(U)
蛋白浓度
(mg/mL)
总蛋白
(mg)
比活力
(U/mg)
回收率
(%)
纯化倍数
提取液
100
1
粗酶液
酶液
相关计算公式:
比活力U/mg=
;
纯化倍数=
回收率=
1、在SOD酶提取步骤中应注意的关键问题是什么?
2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些?
实验三双水相体系中蛋白质分配系数的测定
1、了解双水相系统成相的原理和方法;
2、学习双水相相图的制作;
3、掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作;
4、掌握分配系数和萃取收率的计算方法。
双水相系统中使用的双水相是由两种互不相溶聚合物(如聚乙二醇(PEG)与葡聚糖(Dextran))或者互不相溶的盐溶液和聚合物溶液(如PEG与(NH4)2SO4)组成。
双水相系统的制备,一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液,然后将两种溶液按照不同的比例混合,静止一段时间,当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时,就会产生两相。
两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示,它是一根双节线,当成相组分的配比取在曲线下方时,系统为均匀的单相,混合后,溶液澄清透明,称为均相区;
在曲线的上方时,能自动分为两相,称为两相区;
若配比取在曲线上,则混合后,溶液恰好从澄清变为浑浊。
相图是研究两水相萃取的基础。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的分配系数,从而达到分离纯化之目的。
双水相萃取受许多因素的影响,如高分子聚合物种类、分子量及组成、无机盐种类及组成,pH等。
本实验选用PEG—硫酸盐为相系统,萃取酪蛋白。
三、试剂与材料
10mg/mL酪蛋白标准溶液(用0.1MNaOH配制);
0.1MNaOH溶液;
50%PEG2000;
40%硫酸铵溶液;
固体硫酸铵;
双缩脲试剂。
仪器:
天平、恒温水浴、离心机、刻度试管、吸管、分光光度计、试管、移液管等。
1、PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定
取50%PEG2000溶液(w/v)10mL于三角瓶中,用40%硫酸铵溶液(w/v)装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊,记录硫酸铵消耗的体积。
加入1mL水使溶液澄清,继续用硫酸铵滴定至恰好浑浊,重复7次记录每次硫酸铵消耗的体积,计算每次出现浑浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度(w/v),并填入表1中。
以硫酸铵的浓度(w/v)为横坐标,PEG浓度(w/v)为纵坐标,绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。
表1PEG2000-硫酸铵双水相体系相图制作表
(PEG2000=g;
温度t=。
℃)
编号
H2O累计
添加量(mL)
硫酸铵溶液
读数(mL)
三角瓶中
纯硫酸铵
累积量(g)
溶液
总体积(mL)
PEG2000
浓度(w/v)
硫酸铵
2
3
4
5
6
7
8
2、酪蛋白在PEG2000-硫酸铵双水相体系中分配系数和萃取率的测定
在刻度试管中加入0.5mL牛奶,再加入50%的PEG2000溶液10mL,加入固体硫酸铵,使硫酸铵的终浓度为15%(忽略牛奶体积)。
振荡均匀,静置待其分层,分别量取、记录上下相的体积。
分别取上下相溶液1mL于2支试管,按双缩脲方法测定蛋白含量,计算出上下相的酪蛋白的含量和萃取收率。
根据实验所得数据,计算系统的相比,蛋白在双水相系统中的分配系数及收率。
计算公式见下。
表观分配系数:
K=
相比:
R=
收率:
式中:
C上、C下分别为上、下相蛋白浓度;
V上、V下分别为上、下相的体积。
(关注下上下相蛋白总量与加入的蛋白总量是否一致?
)
1、如何正确地绘制相图?
如何根据相图配制双水相体系,并对混合物进行分离?
2、试讨论PEG分子量及硫酸铵浓度对双水相萃取酪蛋白效果的影响。
3、实验操作中应注意哪些问题?
分析试验误差。
实验四离子交换树脂总交换容量的测定
1、通过实验,加深对离子交换树脂的重要性能之一—总交换容量的认识。
2、熟悉静态法和动态法测定总交换容量的操作方法。
离子交换树脂是一种高分子聚合物的有机交换剂,具网状结构,在水、酸、碱中难溶,对有机溶剂、氧化剂、还原剂及其它化学试剂具有一定的稳定性,对热也比较稳定。
在离子交换树脂的网状结构的骨架上,有许多可以与溶液中离子起交换作用的活性基团,例如-SO3H、-COOH、=NOH等。
离子交换树脂根据其基团的种系分为苯乙烯系树脂和丙烯酸系树脂,树脂中的化学活性基团的种系决定了树脂的主要性质和种系。
首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂,它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行交换。
阳离子树脂有分为强酸性和弱酸性,阴离子交换树脂又分为强碱性和弱碱性两系。
离子交换树脂主要性能参数包括:
含水量,膨胀度,密度,交换容量,滴定曲线等。
交换容量Q是表征树脂性能的重要数据,用单位质量干树脂或者单位体积湿树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数来表示。
732#(001×
7)系强酸性阳离子交换树脂(强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂——一种磺酸化苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂,不溶于水,不溶于酸和碱的稀释液,适合用于软化剂顺向再生纯化系统)与碱作用生成水为一不可逆反应,故可用静态法测定总交换量:
RH+NaOH→RNa+H2O;
用标准HCl滴定剩余NaOH含量来测定总交换容量。
717#(201×
7)系强极性苯乙烯系Ⅰ型阴离子交换树脂,不溶于常规有机溶剂,本品系苯乙烯-二乙烯苯共聚交联结构高分子基础上带有季胺基[-N(CH3)3],其碱性相当于一般季胺碱,在酸性、中性甚至碱性介质中显示离子交换功能。
阴离子交换树脂不能用羟型测定交换容量,因为羟型阴离子交换树脂在高温下易分解,故测水含量不准确,且当用水洗涤时,羟型树脂要吸附CO2,而使部分树脂成为碳酸型,所以应用氯型树脂来测定:
R(≡NHCl)2+NaSO4→R(≡NH)2SO4+2NaCl。
首先用足量的盐酸处理成氯型的,然后采用Na2SO4洗脱,最后AgNO3标准溶液滴定流出液中Cl-含量而测定其总交换量。
本实验采用静态法和动态法测定732#树脂的总交换容量。
阳离子交换树脂732#(H型)
饱和食盐水、2%-4%NaOH、5%HCl、0.1MNaOH标准溶液、0.1MHCl标准溶液、0.5MNa2SO4溶液、
0.1%甲基橙指示剂、0.2%酚酞乙醇指示剂。
250mL三角瓶;
交换柱;
250mL容量瓶,酸式滴定管;
铁架台、玻璃棉等。
1、树脂的预处理
首先使用饱和食盐水,取其量约等于被处理树脂体积的两倍,将树脂置于食盐溶液中浸泡18-20小时,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出水不带黄色;
其次再用2%-4%NaOH溶液,其量与上相同,在其中浸泡2-4小时(或小流量清洗),放尽碱液后,冲洗树脂直至排出水接近中性为止;
最后用5%HCl溶液,其量亦与上述相同,浸泡4-8小时,放尽酸液,用清水漂流至中性待用。
2、树脂含水量的测定
精确称取事先处理好并抽干的732#阳树脂2克,105℃下烘干至恒重,按下式计算含水量:
W%=
其中W1为烘前树脂重,W2为烘后树脂重
3、静态法测定总交换容量
精确称取事先处理好并抽干的732#阳树脂2克,放入250mL三角瓶中,用吸管吸取100mL0.1MNaOH标准溶液,加入树脂中,将树脂全部浸入溶液中,放置24小时。
用移液器取出25mL放入250mL三角瓶中,加入2-3滴甲基橙作指示剂,用0.1MHCl标准溶液滴定至溶液由黄色变为红色为滴定终点,平行测定三份。
将结果记入实验记录表中。
4、动态法测定总交换容量
用长玻璃棒将润湿的玻璃棉塞在交换柱的下部(使其平整),关闭出水口,加10mL纯水。
精确称取事先处理好并抽干的732#阳树脂10克,加水后湿法装柱(防止混入气泡)。
在装柱及之后的过程中,必须使树脂层始终浸泡在液面下约1cm处。
水洗树脂至中性,放出多余的水。
为防止之后的加试液时,树脂被冲起,在树脂上面也铺一层玻璃棉。
向交换柱内不断加入0.5MNa2SO4溶液,用250mL容量瓶收集流出液,调节流量为2mL/min,流过100mLNa2SO4后,经常检查流出液的pH,直至其pH与加入的Na2SO4pH相同,停止交换。
将收集液稀释到刻度,摇匀。
移液管移取25.00mL流出液于250mL锥形瓶,加2滴酚酞,用0.1MNaOH标准溶液滴定至微红色半分钟不褪色,平行测定三份。
实验记录表
静态法
动态法
第一次HCl滴定用量(mL)
第一次NaOH滴定用量(mL)
第二次HCl滴定用量(mL)
第二次NaOH滴定用量(mL)
第三次HCl滴定用量(mL)
第三次NaOH滴定用量(mL)
平均滴定用量V1(mL)
平均滴定用量V2(mL)
湿树脂质量G(g)
树脂质量G(g)
树脂含水量W
HCl的摩尔浓度M1(mol/L)
NaOH的摩尔浓度M2(mol/L)
1、静态法总交换量的计算:
总交换容量(mmol/g干树脂)=
2、动态法总交换量的计算:
1、什么是离子交换树脂的交换容量两种交换容量的测定原理是什么?
2、为什么树脂层不能存留有气泡?
若有气泡如何处理?
3、怎样装柱?
应分别注意什么问题?
注意事项
1.静态法测定时,不要将树脂吸入三角瓶中;
2.湿法装柱时,树脂不能漏掉,可以用蒸馏水冲洗完全,保证下一步中洗脱数据的正确性;
3.液体不能流干,柱中不能产生气泡,保证柱子在洗脱时流畅性和完全性。
4.滴定所用三角瓶要用去离子水洗一洗,不能有离子,以免影响滴定结果;
5.洗脱过程中保持流速为2ml/min,不可过快,不然洗脱不完全,实验数据存在误差;
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生物 分离 工程 实验 讲义 09