微生物学实验教学大纲Word格式.docx

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中试管[（13～15）mm×

（100～150）mm]:

装液体培养基培养细菌或做斜面用；

用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。

小试管[（10～12）mm×

100mm]:

一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。

2、容量瓶

主要用于准确配制一定浓度的溶液，它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶颈上刻有标线。

3、量筒

用来量取液体体积的一种玻璃仪器，外壁上有刻度。

常用量筒的规格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。

4、三角瓶

用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。

5、烧杯

呈圆柱形，顶部的一侧开有一个槽口，便于倾倒液体，有些烧杯外壁标有刻度，可以粗略地估计烧杯中液体的体积，这种烧杯叫印标烧杯，也叫刻度烧杯，其分度并不十分精确，允许误差一般在±

5%。

6、烧瓶

通常具有圆肚细颈的外观，因瓶口很窄，不适用玻璃棒搅拌，若需要搅拌时，可以手握瓶口轻微转动手腕即可顺利搅拌混匀。

烧瓶随其外观的不同分为圆底烧瓶和平底烧瓶两种，通常平底烧瓶用在室温下的反应，而圆底烧瓶则用在较高温的反应，这是因为圆底烧瓶的玻璃厚薄较均匀，可承受较大的温度变化。

7、三角烧瓶（锥形瓶）

锥形瓶瓶体较长，底大而口小，盛入溶液后，重心靠下，极便于手持振荡，故常用于容量分析中作滴定容器。

也可以供加热、煮沸、贮存、消毒各种液体用，常用容量有：

100ml、250ml、500ml、1000ml等。

8、烧杯

用来配制培养基与各种溶液等。

9、离心管

常用的有0.5ml、1.5ml、10ml、15ml、20ml等规格，其上有刻度，专供离心机使用。

主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心，DNA或RNA的检测和提取等。

10、移液管和吸管

均用于吸取和转移少量液体。

移液管上刻有标线，在标明的温度下，当吸取溶液至弯月面与标线相切后，让溶液自然放出，此时所放出溶液的体积即等于管上所标的体积。

常用的移液管有1mL、2mL、5mL、1OmL等。

吸管常用的规格有两种：

一种为无刻度的毛细管；

另一种为有刻度吸管，管壁有精细的刻度。

一般长为25cm，常用的容量为0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、1OmL。

11、染色缸

有方形和圆形两种，方形的较大，可放10张载玻片，圆形的较小，可放5张载玻片，供细菌、血液及组织切片的标本染色用。

12、漏斗

分短颈和长颈式两种。

漏斗直径大小不等，有60mm、100mm和150mm等几种不同规格，供分装溶液或者上垫滤纸、纱布、棉花作过滤杂质用。

13、滴瓶

有橡皮帽式和玻塞式，分无色和棕色，容量有30mL和60mL等，供储存试剂或染色液用。

14、下口瓶

分为有龙头和无龙头两种。

容量有2500mL、5000mL两种规格。

供存放蒸馏水或常用的消毒药液用。

15、培养皿

由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。

在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。

16、载玻片及盖玻片

载玻片主要用于微生物涂片、染色，做形态观察等。

另有凹玻片，就是在一块厚玻片当中有一圆形凹窝，做悬滴观察活细菌及血清学试验用。

盖玻片为极薄的玻片，用于标本封闭及悬滴标本等。

17、德汉氏小管

观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6mm×

36mm），此小管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。

18、双层瓶

由内外两个玻璃瓶组成，内层小锥形瓶放香柏油，供油镜观察微生物时使用，外层瓶放二甲苯，用以擦净油镜头。

19、接种工具

接种工具有接种环，接种针，接种钩，接种铲，玻璃涂布器等。

为细菌学检验工作中接种、分离细菌或挑取菌落制作涂片所必不可少的工具。

接种环常装于铝质的握柄上，用坏后可随时更换。

二、玻璃器皿的洗涤方法

1、新玻璃器皿的洗涤

在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。

2、旧玻璃器皿的洗涤

（1）试管、培养皿、三角瓶：

洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗。

A装有固体培养基：

刮掉，洗涤。

B带菌的器皿：

2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时或煮沸0.5小时，然后洗涤。

C带病原菌培养物的器皿：

先高压蒸汽灭菌，倒去培养物。

（2）玻璃吸管：

吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，反复冲洗。

A吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：

立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后集中冲洗。

B塞有棉花的吸管：

用水将棉花冲出，然后冲洗。

C吸过含有微生物培养物的吸管：

2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时然后洗。

D吸管内壁有油垢：

洗涤液中浸泡数小时，再冲洗。

洗净后的试管倒置于试管筐内，三角瓶倒置于洗涤架上，培养皿的皿底和皿盖分开，依次压着皿边排列倒扣在桌上,晾干。

洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示完全洗净，若还挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗。

三、各种器皿的包扎

1、培养皿的包扎：

培养皿常用旧报纸紧紧包裹（也可用金属筒包装），一包7～10套，包好后干热或湿热灭菌。

2、吸管的包扎：

在上端约0.5cm处，塞入一小段1.5cm长的棉花（勿用脱脂棉），目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎将菌液吸出管外。

然后用4～5cm宽的长纸条包扎。

3、试管和三角瓶等的包扎：

试管口和三角瓶瓶口塞棉花塞或硅胶塞；

用二层报纸包扎好（如有牛皮纸，效果更好），进行干热或湿热灭菌。

试管较多时，一般7个或10个一组，再用双层报纸包扎。

附：

棉塞的制作：

棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水份的蒸发，故在微生物工作中一直普遍使用着。

做棉塞的要求：

松紧适中，不能太松也不能太紧，太松达不到滤菌的目的，并且易脱落，太紧通气不好，操作不便，做到手拿不掉，又易转动；

深浅适度，棉塞总长1.5寸左右，约有1/3在试管外，2/3在试管内，顺时针方向塞入。

棉花要求采用普通棉花，它能防潮不易吸水，不要用脱脂药棉，它易吸水又昂贵。

（由教师示范）

实验材料和用品

以上所有器皿。

（二）实验二环境微生物的检查

1、证明实验室环境与体表存在微生物；

2、比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型；

3、观察不同类群微生物的菌落形态特征；

4、体会无菌操作的重要性。

实验原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。

每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。

因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

1、环境微生物的检测：

倒平板、接种环境微生物；

2、灭菌器皿的准备：

学习包扎平皿、移液管。

1、材料：

环境中各种微生物；

2、用品：

牛肉膏蛋白胨培养基、无菌平皿、移液管、平皿、酒精灯、牛皮纸、记号笔。

（三）实验三显微镜的构造、性能和使用方法

1、学习掌握油镜的规范使用方法；

2、复习掌握光学显微镜的基本结构及使用方法。

油镜工作原理：

1、增加照明亮度；

2、显微镜的分辨力：

指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。

它与接物镜的数值孔径成正比，与光的波长成反比。

分辨力=（1/2光波长度）/数值孔径

1、复习显微镜的使用方法；

2、油镜的使用原理、操作要点（包括清洁方法）；

3、当堂考核油镜使用方法，合格方能通过。

学生显微镜、细菌三型装片；

双层瓶（内装香柏油和乙醚——酒精擦拭液）、擦镜纸。

（四）实验四细菌的简单染色与显微观察

1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法；

2、初步认识细菌的个体形态、菌落形态特征；

3、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的染料有：

美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

1、微生物菌落形态的观察：

几种代表类型微生物菌落形态特征了解、辨识；

2、细菌简单染色及个体形态的观察：

无菌接种操作；

涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥、镜检。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、环境微生物检测平板；

学生显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和乙醚——酒精擦拭液）、擦镜纸；

吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液）。

（五）实验五革兰氏染色

1、学习并初步掌握革兰氏染色法；

2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。

该染色法能将细菌分为G－菌和G＋菌，是基于这两类细菌的细胞壁结构和成分不同。

G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。

G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

1、革兰氏染色法基本步骤：

制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检；

2、染色成败原因分析；

3、实验操作考核一。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；

革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、番红液）。

（六）实验六细菌的芽孢染色法

1、学习并掌握芽孢染色法。

2、观察芽孢的形态特征：

形状、大小及着生位置。

芽孢染色法是利用芽孢和菌体对染色体的亲合力的不同的原理，用不同的染色体进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。

芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，所以我们必须采取着色力强、浓度高的孔雀绿染液（5%）进行染色：

染色过程中延长染色时间，10分钟（一般为2～3分钟）并且在加热条件下进行染色。

进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再利用复染液进行复染，此时菌体就被染成红色，而芽孢难以着色，仍呈绿色。

1、涂片：

将培养24小时枯草杆菌作涂片、干燥、固定。

2、染色：

涂片上盖上一张2.5×

2cm滤纸片，在上面滴加5～6滴孔雀绿（不易过多，以铺满滤纸为宜），用镊子加在载玻片在火焰上徐徐加热，使燃料冒蒸汽（但不沸腾），切勿使燃料蒸干，随时添加染色液，保持10分钟（从冒蒸汽时开始计时）。

3、冲洗：

取下冷却，取掉滤纸，冲洗至孔雀绿不再退色为止。

4、复染：

用番红液复染1～2分钟，水洗，气干。

5、镜检：

待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物；

5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水、香柏油、二甲苯；

普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等。

（七）实验七细菌鞭毛染色及运动性观察

1、学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；

2、学习用压滴法观察细菌的运动性。

鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项重要形态特征。

细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02微米，所以，除了很少数能形成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。

要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。

1、硝酸银染色法染色；

2、压滴法观察细菌的运动性。

变形杆菌；

鞭毛染色液（鞭毛染色液A、鞭毛染色液B）。

（八）实验八酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

2、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别。

酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）；

学生显微镜、酒精灯、载玻片、接种环；

0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液。

（九）实验九霉菌的形态观察

1、学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；

2、初步了解霉菌的形态特征。

霉菌的形态结构观察：

霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3～10微米），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

霉菌的观察（试管直接观察法）。

细黄链霉菌或青色链霉菌、黑曲霉、根霉；

学生显微镜、体视镜、酒精灯、载玻片、镊子等。

（十）实验十培养基的配制与灭菌

1、了解培养基的配制原理；

2、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；

3、了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；

掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。

培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。

培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。

根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。

由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。

基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。

其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

干热灭菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。

从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

1、配制牛肉膏蛋白胨等培养基；

2、高压蒸汽灭菌方法灭菌。

1、试剂：

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂粉；

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、移液管、高压蒸汽灭菌锅等。

（十一）实验十一微生物的分离与纯化

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。

在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。

分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。

分离纯化常用的方法有：

1、简易单细胞挑取法

它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。

2、平板分离法：

选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

1、土样样品的采集；

2、倒平板；

3、平板涂布法；

4、制备土壤稀释液；

5、稀释倾注法。

1、材料：

校园土、牛肉膏蛋白胨培养基（12ml）；

2、用品：

无菌培养皿、无菌刮铲、1ml无菌吸管、盛9ml无菌水试管6支、盛90ml无菌水三角瓶一个、酒精灯等。

（十二）实验十二微生物的培养特征

1、了解不同的微生物在琼脂平板、斜面上、和液体培养基中的生长特点。

2、懂得微生物接种技术的重要性与应用面；

3、能描述微生物在琼脂平板、斜面上、和液体培养基中的培养特征。

微生物的培养特征是指微生物在固体、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。

不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。

1、斜面接种；

2、穿刺接种；

3、液体培养基接种；

4、培养；

5、细菌在固体斜面培养特征的观察与描述；

6、细菌在半固体培养基培养特征的观察与描述；

7、细菌在液体培养基中培养特征的观察与描述。

牛肉膏蛋白胨培养基、接种环、接种针、无菌吸管、酒精灯等。

（十三）实验十三菌种保藏

学习并掌握菌种保藏的基本原理，比较几种不同的保藏方法。

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

1、传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2、液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3、冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

4、冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。

保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。

保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

1、斜面低温保藏法；

2、液体石蜡保藏法；

3、液氮冷冻保藏法；

4、冷冻干燥保藏法。

大肠杆菌、酵母菌，放线菌和霉菌；

肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0.5×

1.2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管,冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。

（十四）实验十四微生物数量的测定

1、学习平板菌落计数的基本原理和方法；

2、了解光电比浊计数法的原理，学习、掌握光电比浊计数法的操作方法；

3、了解血细胞计数板计数的原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

平板菌落计数法是将待测样品经适