槲皮素金属配合物的合成及清除自由基能力的研究设计性实验报告Word文档格式.docx
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体,在Fenton反应机制产生羟自由基和光照核黄素产生过氧自由基的体系中进行了响应行为的比较和探讨。
为槲皮素类新型药物的寻找和开发提供了实验基础。
2、材料与方法
试剂:
槲皮素(上海化学试剂二厂,生化试剂);
邻苯三酚;
维生素C,食品级;
Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2);
醋酸锌等试剂,除标明外,其余试剂均为分析纯;
全部实验用水为二次蒸馏水。
仪器:
磁力搅拌器、pHS-3C数字酸度计、722型分光光度计
3、实验方法
3.1配合物的合成
3.1.1槲皮素-铜、铁、锌配合物的合成
按适宜的摩尔比(槲皮素与醋酸铜为2:
1,槲皮素与醋酸锌、氯化铁均为1:
1),分别将金属盐溶液在搅拌下缓慢滴加到槲皮素溶液中。
如:
在不断搅拌下,按摩尔比为1:
1将0.5mol/L的Zn(Ac)2乙醇溶液滴加到0.5mol/L的槲皮素乙醇溶液中,搅拌均匀。
用5%NaOH乙醇溶液调节pH=9,水浴回流搅拌70min,产生沉淀物,静置冷却后过滤,3000r/min离心分离,沉淀用无水乙醇反复洗涤,以除去其中残留的柚皮苷和游离的金属离子,得到粗品。
用丙酮与冰醋酸以1:
1混合溶剂对粗品进行重结晶,析出浅黄色针状晶体,抽滤,45℃真空干燥。
3.2抗氧化活性测定
3.2.1槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定
产生HO·
自由基的反应体系是Fenton反应:
H2O2+Fe2+→OH-+HO·
+Fe3+
自由基一般存活时间比较短而且活性高,而水杨酸能有效捕捉HO·
自由基且产生有色产物。
因此,若在该体系加入一定量的水杨酸,将发生如下反应:
产生的有色物质在510nm处有强吸收。
添加水杨酸后立即测定吸光度值(此值可作为A0)。
若在水杨酸捕捉自由基的体系中添加黄酮类物质,由于黄酮类化合物具有清除HO·
自由基活性,从而降低甚至完全清除HO·
自由基,而使有色物质的浓度降低,在此条件下
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测定吸光度值,则可用来测定黄酮类化合物对HO·
自由基的清除效率。
在25mL比色管中依次加入2mmol/LFeSO4溶液3mL、1mmol/LH2O2溶液3mL,摇匀,再加入6mmol/L水杨酸3mL,摇匀,加入蒸馏水补充至25mL,于37℃水浴加热15min后取出,测其吸光度A0。
另取25mL比色管依次加入2mmol/LFeSO4溶液3mL、1mmol/LH2O2溶液3mL,摇匀,分别加入1.0×
10-4mol/L待测液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,于37℃水浴加热15min后取出,然后加入6mmol/L水杨酸溶液3mL,继续水浴加热15min,取出用蒸馏水补充至25mL,摇匀,测其吸光度Ai。
按下式计算清除率P。
用维生素C作对照实验。
清除率P=(A0-Ai)/A0×
100%
3.2.2槲皮素及槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
)的清除实验
采用邻苯三酚自氧化法测定橙皮苷锌配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
)的清除能力。
取pH为8.2的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液4.5mL,置于25℃水浴中预热20min,分别加入1mL试样(1.0×
10-4,2.0×
10-4,3.0×
10-4,4.0×
10-4,5.0×
10-4)和0.4mL25mmol/L邻苯三酚溶液,混匀后于25℃水浴中反应5min,加入8mol/LHCl1mL终止反应,快速测定325nm处的吸光度值Ai,空白对照组A0以相同体积的蒸馏水代替样品,按下式计算清除率P。
清除率(%)=(A0-Ai)/A0×
4数据记录与处理
4.1槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定
1.0*10~-4mol/L待测液
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
Vc吸光度
0.4850
0.0420
0.0360
0.0310
0.0290
0.0250
清除率
0.0000
0.9134
0.9258
0.9361
0.9402
0.9485
表1槲皮素对羟自由基的清除作用测定
图1槲皮素对羟自由基的清除作用测定
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表2槲皮素-铁配合物对羟自由基的清除作用测定
Fe的吸光度
0.0240
0.0180
0.0150
0.0100
0.0040
0.9505
0.9629
0.9691
0.9794
0.9918
图2槲皮素-铁配合物对羟自由基的清除作用测定
表3槲皮素-铜配合物对羟自由基的清除作用测定
46
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
Cu的吸光度
0.4850
0.2010
0.1820
0.1400
0.0950
0.0620
0.0000
0.5856
0.6247
0.7113
0.8041
0.8722
图3槲皮素-铁配合物对羟自由基的清除作用测定
4.2槲皮素及槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
表1槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
)的清除测定
待测液浓度mol/L
参比(水)
1.0*10~-4
2.0*10~-4
3.0*10~-4
4.0*10~-4
5.0*10~-4
Vc的吸光度
0.4970
0.0270
0.0210
0.0010
0.9457
0.9577
0.9698
0.9920
0.9980
图1槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
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表2槲皮素-铁配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
0.4350
0.3210
0.2490
0.1810
0.1330
0.1247
0.3541
0.4990
0.6358
0.7324
图2槲皮素-铁配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
表3槲皮素-铜配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
48
0.2030
0.1630
0.1290
0.1100
0.0750
0.5915
0.6720
0.7404
0.7787
0.8491
图3槲皮素-铜配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
5结果分析讨论
5.1槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定
槲皮素及其槲皮素一金属配合物的基本结构单元为黄酮醇,在骨架的3,5,7,3,4位都有羟基和酚羟基,易被氧化,从而起到清除生物体内氧自由基的作用,从实验结果看出,槲皮素及其槲皮素一金属配合物与O2·
和·
OH的反应活性表现不同,表明槲皮素及其槲皮素一金属配合物与0·
OH反应的活性部位和作用机制可能不相同[1]。
张英等[2]对黄酮类化合物的研究证明,B环邻二酚羟基(3,4邻二酚羟基),是清除·
OH的关键功能团,在抗氧化剂的作用机制中,通过酚羟基与氧自由基反应生成较稳定的半醌式自由基,从而终止链式反应是最主要的。
而在清除01I·
过程中,黄酮环共轭体系对未配对电子的离域化可能在稳定黄酮自由基中间起主导作用。
C一2,3位双键,4一OH是清除0·
的关键活性部位。
[3]
以上结论可能对槲皮素及其金属配合物也适用。
当槲皮素按物质的量比为2:
1接入铜、铁离子后,环上的3位羟基与4位羰基与铜、铁离子键合而改变了其抗氧化活性,槲皮素强大的共轭环使其作为酸配体与钼形成配合物后,整个配合物又作为更强的路易氏酸来接受O2·
的耵电子,有效的电子离域化的结果使槲皮素铜、铁配合物与0·
反应的中间体可能更加稳定;
另一方面,·
OH的活性主要表现在它的氧化性上,因此,3,4邻二酚羟基和3-OH很敏感,从而表现出槲皮素一铜、铁配合物对·
OH的清除作用比槲皮素高。
[4]
5.2槲皮素及槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-·
本研究结果显示,槲皮素一铜配合物对0=·
有较强的清除能力,槲皮素一铁配合物
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稍微逊色点,在一定浓度范围内,与其浓度成正比,并且明显优于槲皮素;
槲皮素和槲皮素一铜、铁配合物都具有较好的清除·
OH的活性,在低浓度时,槲皮素一铜、铁配合物优于槲皮素,在高浓度时槲皮素比槲皮素一金属配合物的抑制率高,因此,控制一定槲皮素一金属配合物的浓度,使槲皮素一金属配合物发挥其较强的清除羟基自由基的作用,进一步对槲皮素一金属配合物的生物活性进行研究,为黄酮类药物的研究提供一种新的思路和途径[5]。
6参考文献
[1]贾小燕李文杰柴保臣朱明君阎素清槲皮素--钼配合物的抗氧化作用郑州大学学报(医学版)2008年5月第鲞箜塑
[2]张英,吴晓琴.黄酮类化合物结构与清除活性氧自由基效能关系的研究[Jj.天然产物研究与开发,1998,10(4):
26
[3]夏玉明朴惠善许妍姬沈光海郑云花《槲皮素过渡金属锌配合物的合成》延边大学学报:
自然科学版1999-25-1
[4]吴新建,林素英,李荣华槲皮素与3d一过渡金属二价离子的配位反应研究福建师范大学学报:
自然科学版2007-23-6
[5]谭君一,王伯初,祝连彩《槲皮素金属配合物的药理作用研究进展》文章编号:
1001—2494(2006)22—1688—04中国药学杂志2006-41-22
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