气相色谱质谱法同时测定动物尿样中莱克多巴胺和克伦特罗百度精Word下载.docx
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加标回收率为92.3%~112.2%,批内相对标准偏差≤6.9%。
关键词:
固相萃取2气相色谱2质谱法;
莱克多巴胺;
克伦特罗;
残留量;
动物尿样
中图分类号:
O657.63;
R974.3 文献标识码:
A 文章编号:
100422997(200602274205
SimultaneousDeterminationofRactopamineandClenbuterolResidues
inAnimalUrinewithGasChromatography2MassSpectrometry
YINGYong2fei1,PIXiong2e2,WUPing2gu3,CHENHui2hua1,ZHUCong2ying1,LUChun2bo1
(1.AnimalProductsQualityTestingCenterofZhejiangProvince,Hangzhou310020,China;
2.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology,ZhejiangAcademicofAgricultureScience,
Hangzhou310021,China;
3.DiseasePreventandControlCenterofZhejiangProvince,Hangzhou310020,China
Abstract:
Anewsolidphaseextraction2gaschromatography2massspectrometry(SPE2GC/MSmethodforsimultaneousdeterminationofractopamineandclenbuterolinanimalurinewasreported.Thedrugswereextractedwithethylacetatefromsample.Theextractionwasevaporatedat40℃.Aftertheresiduewasdissolvedinethylacetate,itwaspurifiedbypassingthroughSLHsolid2phaseextraction(SPEcartridges.TheeluatewasevaporatedbynitrogenblowandderivatizatedwithBSTFA,andthenassayedbyGC/MS.Thelimitsofdetection(LODwere0.3μg/L,andthelimitsofquantitation(LOQwere1.0μg/L.Thecalibrationcurveswerelinearbetween0.02μg/mLand1.0μg/mLforractopamineandclenbuterol.Recoveriesofractopamineandclenbuterolwere78.6%2101.2%and92.3%2112.2%,andtheintra2relativestandarddeviation(n=5lessthan7.0%and6.9%,re2spectively,atspikedlevelsof4.0~20μg/L.
Keywords:
solidphaseextraction2gaschromatography2massspectrometry(SPE2GC/MS;
ractopamine;
clenbuterol;
residues;
animalurine
莱克多巴胺和克伦特罗属于β2兴奋剂,具有促进动物体内营养物质由脂肪组织向肌肉组织转移的作用。
但是动物在食用含莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的饲料后,会造成肌肉及组织中不同程度的残留,人体过量的摄入这种药物会发生中毒等毒副作用。
因此,很多国家严禁使用含有此类药物的动物饲料,并制定了其在动物性食品中的最高检出限[1],我国已经明确将莱克多巴胺和盐酸克伦特罗列入禁用药品目录[2]。
动物组织中β2兴奋剂的仪器检测方法主要有高效液相色谱法[325]、气相色谱2质谱法[629]和液相色谱2质谱法[10212]。
由于β2兴奋剂在动物体内代谢较快,往往以原形排出体外,检测动物尿样具有取样方便、快速、准确等特点,建立动物尿样中莱克多巴胺和克伦特罗的检测方法,可以对畜产品整个生产过程中使用β2兴奋剂的现象进行有效监控。
本文采用气相色谱2质谱法,建立了动物尿样中两种β2兴奋剂的残留检测方法,同时进行阳性样品的确证和定量分析。
本法测定准确度和精密度高,阳性判定结果准确可靠,检出限和应用范围满足目前国内外检测限量的要求[1,13]。
1 实验部分
1.1 主要仪器
GC6890N25973气相色谱2质谱仪(带自动进样器:
美国安捷伦(Agilent公司产品,配MSDChemStation工作站,NIST2.0a谱库;
Sigma2k15冷冻离心机;
Bü
CHIB2490旋转蒸发仪;
MS2minishaker漩涡混匀器;
METTLERAG2285电子天平;
氮吹仪;
自制10个样位的固相萃取装置。
1.2 主要材料与试剂
盐酸克伦特罗:
中国药品生物制品检定所提供;
莱克多巴胺:
浙江省兽药监察所提供;
N,O2双(三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA:
美国SUPELCO公司提供;
甲苯:
色谱纯,美国TE2DIA公司提供;
实验用水为milli2Q超纯水;
其它试剂均为分析纯。
固相萃取柱包括聚苯乙烯柱(SLA,硅藻土和硅胶柱(SLH,SCX柱,C18柱,硅胶柱等规格为100mg/mL,以上柱子均由杭州富裕科技服务有限公司提供。
1.3 标准溶液的配制
分别精密称取25mg莱克多巴胺和盐酸克伦特罗对照品置于同一100mL棕色量瓶中,用甲醇溶解后定容,摇匀,为对照品储备液,置于-20℃冰箱中保存。
使用时用甲醇稀释至所需浓度即可。
1.4 仪器条件
1.4.1 色谱条件 色谱柱:
HP25MS石英毛细管柱(30m×
0.25mm×
0.25μm;
升温程序:
初始温度120℃,保持3min,以15℃/min的速率升温至230℃,保持5min,然后以15℃/min的速率升温至280℃,保持10min;
进样口温度250℃;
载气(高纯氦流速:
1.0mL/min;
不分流进样,进样量1μL。
1.4.2 质谱条件 电子轰击(EI离子源;
电子能量70eV;
离子源温度230℃;
接口温度280℃;
溶剂延迟时间10min;
采用选择离子监测(SIM模式进行检测,具体条件见表1。
1.5 样品处理
1.5.1 试样提取 量取动物尿样10.0mL至50mL聚丙烯离心管中,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为10.0±
0.1,摇匀后加入1g氯化钠,轻摇数秒,加10mL乙酸乙酯提取,涡旋2min,中速振荡10min,7000r/min离心5min,取上清液经无水硫酸钠过滤,收集于50mL鸡心瓶中;
另取10mL乙酸乙酯重复提取一次。
用2mL乙酸乙酯洗涤无水硫酸钠,提取液旋转蒸发至干。
1.5.2 试样净化 固相萃取柱先经5mL乙酸乙酯润洗;
用2mL乙酸乙酯溶解鸡心瓶中的残留物,过SLH固相萃取柱;
另取5mL3%甲醇/乙酸乙酯洗涤鸡心瓶中的残留物一次,过柱;
再用5mL50%甲醇/乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液于5mL具塞玻璃试管中,氮气吹至干。
1.5.3 试样衍生和检测 加0.1mLBSTFA于1.5.2所得剩余物中,加盖并于漩涡混合器上涡旋振荡1min,密封后在80℃的烘箱中衍生1.0h,冷却后氮气吹至干,加入0.2mL甲苯溶解,进行GC/MS分析。
2 结果与讨论
2.1 质谱定性定量分析
57
第2期 应永飞等:
由于莱克多巴胺和克伦特罗都是沸点较高
的极性物质,且都含有—OH结构,直接采用气相色谱进行分离较为困难。
为了改善其气相色谱性质,在进行仪器检测前必须对样品进行衍生化。
莱克多巴胺和克伦特罗经BSTFA衍生化后,所含羟基上的氢均被三甲基硅烷(TMS所取代,此时的色谱行为良好。
衍生化后莱克多巴胺和克伦特罗的质谱图见图1,由质谱图可知,莱克多巴胺的衍生物在m/z179、250、267、502有特征离子,这些碎片离子的比例关系可用于莱克多巴胺的定性分析。
定量离子采用m/z250,因为此特征离子有一定的丰度,而且受杂质的干扰较少。
克伦特罗的衍生物在m/z86、243、262、277有特征离子,这些碎片离子的比例关系可用于克伦特罗的定性分析。
定量离子采用m/z86,因为此特征离子丰度最高,有助于提高
检测的灵敏度。
由于莱克多巴胺和克伦特罗的色谱保留时间相差较大,8个监测离子分为两组进行扫描,以提高检测的灵敏度。
表1是莱克多巴胺和克伦特罗的保留时间和质谱条件。
2.2 线性方程和检测限
按1.4建立的仪器条件,取浓度范围在0.02~1.0μg/mL的莱克多巴胺和克伦特罗混合标准溶液各0.2mL,氮气吹干后,按1.5.3的方法衍生后进行GC/MS分析。
分别以m/z250和m/z86离子的峰面积对浓度作图,所得标准曲线方程分别为:
Y=2766X-18.28和Y=4271X-38.82,相关系数r分别为0.9974和0.9981。
以3倍信噪比为检出限(LOD,计算得到试样中莱克多巴胺和克伦特罗的检出限为0.3μg/L,均优于文献报道[728]
。
图1 (A莱克多巴胺和(B克伦特罗的EI2MS谱
Fig.1 EImassspectraof(Aractopamineand(Bclenbuterol
表1 莱克多巴胺和克伦特罗的保留时间和质谱条件
Table1 GCretentiontimeandoptimizedMSconditionsforractopamineandclenbuterol
化合物
Compound
开始时间
Starttime
t/min
保留时间
Retentiontime
tR/min
甲基化数
TMSnumber
n
选择离子
Selectedions
m/z
定量离子
Quantificationion
莱克多巴胺
ractopamine
1319.553250,267,179,502250
clenbuterol
1011.07186,243,262,27786
67质谱学报 第27卷
2.3 固相萃取条件的确立
2.3.1 固相萃取柱的选择 目前,兽药残留检测中最常用的净化手段是固相萃取(SPE法,用于β2兴奋剂净化的固相萃取柱有硅藻土、C8、C18、硅胶、阳离子交换柱、DAU柱等。
本课题组对SLA、SLH、SCX、C18、硅胶5种SPE净化柱除杂及过柱回收率进行了比较,结果见表2。
经过以上比较,选择SLH型SPE柱作为动物尿样中莱克多巴胺和克伦特罗净化柱,样品提取物经过SLH柱净化后,可以达到较好的净化效果,过柱回收率在85%以上。
2.3.2 固相萃取条件的确定 固相萃取柱先经5mL乙酸乙酯润洗和活化。
用2mL乙酸乙酯溶解鸡心瓶中的残余物,淋洗液过SLH固相萃取柱。
用3%甲醇/乙酸乙酯溶液淋洗柱子,当淋洗液为5mL时回收率较高,而且杂质干扰较少。
然后用50%甲醇/乙酸乙酯溶液洗脱收集,先用5mL洗脱液洗脱,另取5mL洗脱液重复一次,同法检测,未发现莱克多巴胺和克伦特罗,说明5mL可以将吸附在柱子上的莱克多巴胺和克伦特罗完全洗脱。
故理想的淋洗液用量为3%甲醇/乙酸乙酯溶液3mL,洗脱液用量为50%甲醇/乙酸乙酯溶液5mL。
图2是莱克多巴胺和克伦特罗对照品、空白加标样品和空白样品的总离子流(TIC图。
此时,上机液中莱克多巴胺和克伦特罗的浓度为0.2μg/mL(即加标量为4μg/L。
2.4 重复性试验
取同一批号的空白动物尿样,加适量混合标准工作液,使莱克多巴胺和克伦特罗的加标量在1.0~20μg/L,按1.5项下的方法处理后进行分析。
每个浓度点取5份样品,求其平均回收率,并计算批内相对标准偏差。
表3是加标量为4.0~20μg/L时的回收率结果。
由表3的数据可知,动物尿样中莱克多巴胺加标浓度为4.0~20.0μg/L时,回收率比较稳定。
此时的批内相对标准偏差≤7.0%,回收率在78.6%~101.2%;
而克伦特罗的加标量为4.0~20.0μg/L时,批内相对标准偏差≤6.9%,回收率在92.3%~112.2%。
2.5 样品分析
应用建立的分析方法,对经酶联免疫(ELISA法筛选得到的莱克多巴胺阳性样品和克伦特罗阳性样品各10份进行测定,其中1份样品检测出含有克伦特罗,含量为2.1μg/L;
2份样品检测出含有莱克多巴胺,含量分别为26.3μg/L和12.9μg/L。
该检测结果表明,本方法能满足我国对动物尿样中莱克多巴胺和克伦特罗进行监控的需要[13]。
表2 不同净化柱净化效果比较
Table2 Comparisonofexperimentalresultsindifferentcartridges
SLASLHSCXC18silicagelrecovery/%ractopamine72.292.969.559.562.5recovery/%clenbuterol65.386.576.260.246.5去脂degreasingclearclearclearunclearunclear脱色decoloringunclearclearunclearunclearunclear
表3 回收率试验结果
Table3 Recoveriesofractopamineandclenbuterolindifferentspikedlevel
化合物Compound
添加量
Spiked/(μg・L-1
回收率
Recovery/%
平均回收率
Meanrecovery/%
相对标准偏差
RSD/%
4.0589.4,81.7,81.3,88.3,78.682.5
5.0
莱克多巴胺ractopamine10.1290.7,87.1,88.3,91.2,101.292.07.0
20.2596.4,98.5,89.7,100.5,90.294.75.9
4.0294.5,104.2,98.5,112.2,102.4104.3
5.5克伦特罗clenbuterol10.0595.6,110.8,101.5,107.2,10
6.9106.63.8
20.1096.5,102.3,92.3,107.9,106.5102.26.977
图2 总离子流图(A对照溶液;
(B空白加标样品;
(C空白样品
Fig.2 TICof(Areference,(Bspikedsample
and(Cblanksample
1—克伦特罗clenbuterol;
2—莱克多巴胺ractopamine
3 结 论
β2兴奋剂是我国明令禁止使用的药物[2],但由于这些药物的化学结构差别很大,理化性质不同,要实现β2兴奋剂的多残留检测难度很大。
本文建立了同时测定动物尿样中违禁药物莱克多巴胺和克伦特罗残留量方法,大大缩短了检测时间,节约了检测成本。
在本文的色谱条件下,被测样品中的各组分得到较好的分离,出峰时间合适。
该方法条件易于控制,结果准确、加标回收率稳定、重现性好,适用于动物尿样中莱克多巴胺和克伦特罗的定性、定量测定。
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87质谱学报 第27卷
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