苯酚降解菌的分离和鉴定Word文档下载推荐.docx

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[11]

人口服致死量报道不一,LD为2～15g,或MLD为140mg/kg,14g/kg。

国外报道酚液污染皮肤面积为25%,10分钟死亡,血酚为0.74mmol/L。

苯酚是重要的化工原料,被广泛应用于酚醛树脂、杀虫剂、染料、农药和医药的生产中.但苯酚本身是有毒的有机化合物,具有使蛋白质变性的作用,对皮肤粘膜有腐蚀性;

此外,它还可以作用于中枢神经而引起痉挛.美国环保局和我国相继把苯酚列入有毒污染物名单.处理含酚废水的方法很多,其中生物降解法是一种经济有效且无二次污染的方法,许多学者在这方面进行了大量研究.[11]

1.2苯酚降解菌的性质及其用途

苯酚降解菌一般多为不动杆菌、假单胞菌、好氧产碱菌等。

有的可以以苯酚为单一碳源，有的是混合碳源。

目前,治理含酚废水的途径主要有化学试剂法（如萃取、吸附、离子交换、化学沉淀、化学氧化、反渗透、生化处理等）和生物降解两种。

国内外许多学者在生物降解苯酚方面进行了广泛的研究,已鉴定存在苯酚降解能力的微生物有乙酸钙不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus）、假单胞菌（Pseudomonassp.）、富养产碱菌（Alcaligeneseutrophus）等。

苯酚降解菌可用于，降解广泛存在于化工、造纸、钢铁等工业废水中。

含酚的污水，防止由于酚污染而导致的江河湖泊中的鱼虾的死亡,含酚的污水会使庄稼死亡或减产,严重危害人类的健康。

[10]

1.3苯酚降解的研究现状

苯酚降解技术主要有:

1、催化湿式氧化技术：

催化湿式氧化技术是80年代国际上发展起来的一种治理高浓度有机废水的新技术，是在一定温度、压力下，在催化剂作用下，经空气氧化使污水中的苯酚氧化分解成CO2、H2O等无害物质，达到净化目的。

其特点是净化效率高，流程简单，占地面积少。

2、生物强化技术生物强化技术是指在生物处理体系中投加具有特定功能的微生物来改善原有处理体系的处理效果。

投加的微生物可以来源于原有的处理体系，经过驯化、富集、筛选、培养达到一定数量后投加，也可以是原来不存在的外源微生物。

实际应用中这两种方法都有采用，主要取决于原有处理体系中的微生物组成及所处的环境。

这一技术可以充分发挥微生物的潜力，改善难降解有机物生物处理效果。

Selvaratnam等通过在活性污泥中投加苯酚降解菌PsendomonasPvotidaATCC11172，提高了苯酚的去除率，系统在40d内一直保持在95％－100％的苯酚去除率，而没有进行生物强化的对照组中苯酚去除率开始很高，但很快降到40％左右。

3、芬顿试剂技术芬顿试剂对有机分子的破坏是非常有效的，其实质是二价铁离子和过氧化氢之间的链反应催化生成·

OH自由基，三价铁离子催化剂（称芬顿类试剂）也能激发这个反应，这两个反应生成的·

OH自由基能有效地氧化各种有毒的和难处理的有机化合物如苯酚；

或者采用紫外灯作为辐射能源放射紫外线进入废水，当过氧化氢被紫外光激活后，反应产物是一个高反应性的·

OH自由基，这个·

OH基团迅速引发氧化链反应，最终有机化合物被分解为CO2和H2O。

[9]

1.4苯酚降解菌生产菌的筛选

苯酚降解菌的筛选主要有两种方式:

第一种是将从废水中和土壤中富集的细菌进行驯化，使其达到可以以苯酚为单一碳源的高效菌种。

第二种是将自然界得来的细菌直接接入只有以苯酚为单一碳源的培养液中进行缺陷培养，得到的就是可以以苯酚为单一碳源的菌种。

1.5本课题的研究思路及意义

上面提到的主要苯酚处理方式中催化湿式氧化技术优点是经济但是它的催化过程中需要高温高压，消耗能源、水资源而且需要设备的支持，前期投入大。

芬顿试剂技术中催化中需要Fe2+pH限定pH3.5酸性环境催化效率高。

Fe2+可能导致二次Fe2+污染，酸性环境不仅容易造成设备的耐久度降低而且需要大量的碱来中和它。

而生物技术连续性好，反应条件温和，无剧烈反应条件，且不消耗能源，从长远的角度来看它无疑是最好的解决苯酚污染的办法。

而且近年来不少科学家利用科学技术发现了可以使苯酚分解成为细菌的原材料来生产其他生产资料。

所以本课题的要就思路就是筛选自然界中的细菌通过逐步增加培养基中的苯酚含量来驯化得到可以高效分解以及耐受高浓度苯酚的优秀菌种。

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1土样

采自学校操场附近地土壤，学校门口粮油店门口土壤，学校西山土壤。

2.1.2培养基

1、斜面培养基：

牛肉膏3.0g/L蛋白胨5.0g/LNaCL5.0g/L琼脂15g/LpH7.0-7.2

2、富集培养基：

牛肉膏3.0g/L蛋白胨0.5苯酚0.4g/LK2HPO40.1MgSO40.05琼脂15.0g/LpH7.2-7.5。

3、测试培养基：

牛肉膏3.0g/L蛋白胨5.0g/LNaCL5.0g/L苯酚0.4g/L琼脂15g/LpH7.0-7.2

4、筛选培养基：

（NH4）SO42.0g/LMgSO4CaCL20.1g/LK2HPO40.5g/LNaH2PO40.5g/L苯酚0.3g/LpH6.5-7.5

5、测试用苯酚培养液：

（NH4）SO42.0g/L苯酚0.5g/LpH6.5-7.5

6、甲基红（M.R）试验培养基：

蛋白胨5g，葡萄糖5g，KH2PO45g，蒸馏水1000mlpH7.0～7.2

7、乙酰基甲基醇（V.P）实验培养基：

同M.R配制时先将除指示剂外的药品加热溶解、过滤、调pH6.8～7.0，再加指示剂，分装试管。

70kPa灭菌20min。

8、过氧化氢酶试验培养基：

LB肉汤培养基

9、明胶液化培养基：

蛋白胨0.5%，明胶20%，葡萄糖2%，pH7.2～7.4。

115℃高压蒸汽灭菌30min。

10、纤维素水解培养基MgS040.05%，NaC10.05%，K2HPO40.05%，KNO30.1%，pH7.2滤纸片（长5cm，宽0.8cm）121℃高压蒸汽灭菌20min。

2.1.3溶液与试剂

1、菌活性测定用溶液

原FeCl3液:

称取0.77gFeCl3和5ml0.1mol/L的HCL溶于少量去离子水中，然后定容到100mL，贮于棕色瓶中备用（每月制备一次）.

稀FeCl3液:

取lmL原FeCl3液用蒸馏水稀释100倍（每天制备一次）.

2、革兰氏染色液A）结晶紫液甲液:

结晶紫2g，95%乙醇20mL。

乙液:

草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。

将甲、乙两液相混，静置48h后过滤使用，染色液应放置棕色瓶中保存.B）碘液碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水30mL。

先用少量（3～5mL）蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶解后，加入水稀释至300ml。

放置棕色瓶贮存数月。

C）复染液（番红2.5%的乙醇溶液）蕃红2.5g，95%乙醇100mL。

复染液保存于棕色瓶中。

用复染液与蒸馏水1:

4混和即得到革兰氏染色所需的0.5%蕃红水溶液.

3、调用pH酸碱液lmol/L盐酸:

量取36%的浓盐酸86.2mL，用水溶解并定容至1000mL.0.lmol/L盐酸:

lmol/L盐酸10mL，蒸馏水90mL。

lmol/L氢氧化钠称取氢氧化钠40g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL.0.lmol/L氢氧化钠lmol/L氢氧化钠10mL，蒸馏水90mL。

主要试剂均为国产分析纯。

2.14仪器

垂直流超净工作台上海智城分析仪器有限公司

双目型显微镜XSP-4C上海长方光学仪器有限公司

新型恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂

250D恒温光照培养箱常州式华普达教学仪器有限公司

立式灭菌器山东新华医疗器械股份有限公司

电子分析天平SHIMADZUcorporationJapan

艾科普超纯水系统颐洋企业发展有限公司

2.2试验方法

2.2.1苯酚降解菌的初筛

称取土壤5g加入装有50mL无菌水的小三角瓶中，振荡均匀后静置，取上清液进行梯度稀释3次，取稀释液涂布于三个富集培养基上，30℃倒置培养36h，从三个培养基上选取优势菌株进行培养，并先命名为H-1,H-2,H-3。

将H-1、H-2、H-3接入筛选培养基，并将选取同一菌种分别接入测试培养基，30℃倒置培养2d后加入菌活性测定溶液，观察未变色部位大小并记录。

此为原细菌初始分解能力。

2.2.2苯酚降解菌的驯化

将H-1,H-2,H-3分别接入筛选培养液（苯酚为唯一碳源的培养液）并以35℃.120r/min摇床进行培养.每隔1d测一次苯酚浓度（4-氨基安替吡林试剂），待到苯酚分解完后加入比原溶液苯酚稍多的苯酚，如此增加苯酚浓度连续驯化2周使菌种能够完全以苯酚为唯一碳源并快速生长。

在期间注意培养液pH维持在6.8-7.2之间。

苯酚含量大于1000mg/L的的可以考虑回收酚，所以我们的最大酚浓度定为900mg/L

2.2.3菌种在不同条件下的降解能力

温度测试：

将驯化过后的菌种H-1,H-2,H-3分别在不同温度下进行培养，温度区间24-36，以两度为一个梯度增加，其他条件相同，并记录其降解苯酚量，并计算出苯酚在不同温度下的降解率。

pH值测试：

将驯化过后的菌种H-1,H-2,H-3分别在不同pH值下进行培养，pH值区间6.0-8.0，以0.5为一个梯度增加，其他条件相同，并记录其降解苯酚量，并计算出苯酚在不同pH下的降解率。

是否需氧测试：

将驯化过后的菌种H-1,H-2,H-3分别以静止做两组平行测试；

摇床培养做两组平行测试，并记录其降解苯酚量，并计算出苯酚在不同培养状态下的降解率。

然后分析三种菌种得出的结果，并算出那种菌种的降解率最高得出最优菌种及其最适宜条件。

2.2.4最优菌种的鉴定[7]

将得到的最优菌种进行生理生化测试，以及菌种斜面培养基培养所得的菌种外观特性。

2.2.4.1革兰氏染色：

1.取无油迹的干净载玻片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。

2.自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。

3.滴加结紫液，染一分钟。

用水冲净结晶紫液。

4.滴加碘液冲净残水，并覆盖约lmin。

用水冲去碘液，将片上的水甩干。

5.滴加95%乙醇液脱色约20-30sec，并立即用水冲净乙醇.

6.用蕃红液染1～2min。

用水洗净番红，风干，用显微镜油镜观察涂片。

7.菌体红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。

2.2.4.2淀粉水解试验：

取菌种点种于淀粉水解实验培养基平板上，适温培养2～4d，形成菌落后，再平板上滴加卢哥尔氏碘液，以铺满菌落周围为度。

平板呈蓝色。

菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解。

2.2.4.3唯一碳源试验：

取菌悬液接种于唯一碳源培养基（苯酚为唯一碳源），连续移种三代，37℃培养3天，观察是否生长，生长者为阳性。

2.2.4.4M.R.和V.P.试验:

分别将试验菌种装入葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，置于37℃恒温培养2天，取出培养好的试管，沿管壁加入M.R.或V.P.试剂3～4滴，观察是否变色，若M.R.培养液由原来的橘黄色变为红色则为M.R.阳性反应,V.P.培养液中加入等量的40%的KOH溶液，猛烈振荡，2～10min内有红色出现即为V.P.正反应。

2.2.4.5过氧化氢酶试验:

将菌株接种于斜面培养基，28℃恒温培养24～48h；

用接种还取一小环涂抹于已滴有5%过氧化氢的玻璃片上，如果有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性。

2.2.4.6明胶水解试验:

将测试菌接种于明胶水解培养基中，在室温温度下培养15～20d，放入4℃冰箱，观察培养基还能不能凝固，不能凝固者明胶水解为阳性，能凝固者为阴性。

2.2.4.7纤维素水解试验:

将菌种接种在试管中一般浸在无碳源合成培养基内的滤纸条上，于适温培养，第10天时观察结果，如果菌种能在滤纸片上生长，并分解纸条，表示该菌株产生纤维素酶，若纸条不被分解，则该菌株不产生纤维素酶。

第三章结果与分析

3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究

3.1.1筛选结果

3.1.1.1初步筛选的结果

将加入了菌种活性测试液的菌种进行观察发现H-1周围的培养基无红色圈最大，H-3其次，H-2最小，由此可知H-1的原始分解能力最好。

3.1.1.2菌种驯化中的结果

表1菌株H-1、H-2、H-3降解苯酚结果30℃摇床培养

苯酚浓度（mg/L）

H-1降解苯酚浓度（mg/L）

H-2降解苯酚浓度（mg/L）

H-3降解苯酚浓度（mg/L）

H-1降解率%

H-2降解率%

H-3降解率%

200

177

175

88.5

88.1

300

275

265

266

92.11

88.3

400

335

330

332

83.75

82.50

83.00

500

372

360

354

74.40

72.00

70.80

600

319

288

301

53.16

48.00

50.17

700

267

250

240

38.14

35.71

34.28

800

145

115

105

18.13

14.38

13.12

900

67

47

40

7.44

5.22

4.44

由表1可知在续培养驯化当中H-1的分解速率提升速度是最快的。

当在30℃培养1d时其降解率高达92.11%.H-1较为良好。

图一菌株H-1H-2H-3苯酚降解率

表2温度对苯酚降解菌的影响----500ml（500mg/L苯酚）测试培养液摇床培养pH7.5

温度℃

24

302

309

60.4

61.8

60.0

26

340

341

338

68.0

68.2

67.6

28

348

344

346

69.6

68.8

69.2

30

364

361

72.8

72.2

32

74.4

72.0

70.8

34

355

350

358

71.0

70.0

71.6

36

311

308

306

62.2

61.6

61.2

由表2可以看出，问对于苯酚降解菌有着较大的影响，H-3菌的最适温度是30℃，但是当30℃时，H-3的降解率并没有H-132℃时的降解率大，所以H-1菌在温度测试时还是最出色的。

表3pH对苯酚降解菌的影响---500ml（500mg/L苯酚）测试培养液摇床培养30℃

pH值

6.0

46

45

42

9.2

9.0

8.4

6.5

352

349

70.4

69.8

7.0

7.5

8.0

54

52

10.8

10.4

由表3可以看出pH对于苯酚降解菌的影响，他们的最适pH值都是7.0-7.5之间，大于或小于都会影响到苯酚的分解速度。

在最适合pH值中H-1菌依然是最快降解的。

所以H-1菌株依然具有优势。

表4O2对苯酚降解菌的影响-----500ml（500mg/L苯酚）测试培养液30℃pH7.5

通气环境

摇床1

摇床2

371

366

74.2

73.2

静止1

368

342

73.6

71.2

68.4

静止2

356

由表4可以看出，这三种苯酚降解对于O2的需求不是很大，但是在有氧气的环境中会使分解率提高。

3.1.2H-1菌株的性状初步结果

H-1是我所培养且驯化较为成功的菌种，它的最适温度是32℃最适pH7.0-7.5之间。

在苯酚浓度为400mg/L左右的浓度时分解速度最大。

3.2H-1菌株分类鉴定结果

将H-1接种于斜面培养基上30℃培养2d后进行菌落外观观察，并进行生化检测.

在斜面培养基上菌落较小,淡乳黄色微白,圆形或椭圆行突起,革兰氏染色阴性.通过生理生化检测过氧化氢阴性、淀粉水解试验阳性、M.R阴性、V.R阳性、明胶液