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3.实验原理:
3.1渗透势:
渗透势是指因溶质溶解而使水的自由能降低(与纯水相比)的数值,降低的值与溶质的浓度成正比,纯水的水势最大(值定为零),当水中具有溶质,水势便降低,此时的水势称为渗透势,故是负值(渗透势的绝对值等于溶质的渗透压,渗透压为正值)。
渗透势的单位以MPa表示,0.1兆帕(MPa)=106Pa=0.987大气压=1巴(bar)。
植物成熟的细胞都具有液泡,液泡中具有各种溶质,故具有一定的渗透势,液泡外面包裹着活的原生质,原生质外面有细胞壁包围,细胞壁可看作是一层透膜,活的原生质具有选择性,所以整个细胞类似一个渗透系统。
3.1.1质壁分离法:
当细胞放在一种渗透势比其细胞液渗透势低的溶液中时,细胞液中的水向外渗,液泡体积缩小,原生质的胞壁也跟着向内收缩,如水分继续外渗,液泡体积缩小,而胞壁弹性有限,不能继续收缩,原生质就和细胞壁脱离,这就是质壁分离现象。
当细胞放在某一溶液中,细胞内外水分交换达到平衡,即处于渗透平衡状态,此时细胞内的压力势为零,那么细胞液的渗透势就等于该溶液的渗透势,该溶液浓度称为等渗浓度。
利用一系列梯度浓度的溶液,观察质壁分离现象时,细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离现象时(即细胞只是角偶上与胞壁分离)的浓度和与其相邻的尚不能引起质壁分离浓度梯度之间的溶液浓度。
代入公式ψл=-RTiC即可算出其渗透势。
3.1.2冰点下降法:
为了了解植物水分代谢的特征,常常需要测定植物个别器官的细胞液的渗透势,而此时就需要测定所研究器官压榨出的细胞渗透势,而质壁分离法只能了解个别器官的组织或细胞的渗透势,不能满足这个需要。
而在能获得较多的汁液时,冰点下降法就能满足此需要。
据ψл=-RTiC公式,1克分子的非电解质溶液在0℃式的渗透势是ψл=-RTiC=-1*0.082*273=-22.4大气压。
物理学的研究结果告诉我们,溶液的冰点下降和它的浓度成正比,1克分子的任何非电解质的水溶液,它的冰点下降1.86℃,因此一种溶液的冰点下降了1.86℃时,它的渗透势是-22.4个大气压,故只要我们知道任何一个溶液的冰点下降值ΔT,就可以算出它的渗透势。
3.2水势:
水势是水的化学势,既是水中可用于作功或发生化学反应的能量度量。
水总是从水势高的地方向水势低的地方移动,就象电流由高电位流向低电位一样。
植物体细胞之间,组织之间,器官之间以及植物和环境之间的水分移动方向都由它们之间的水势差决定。
当细胞或组织放在溶液中时,如果植物的水势小于溶液的渗透势,即:
ψ细=ψπ+ψρ<ψπ(溶),则水溶液流向细胞中(即细胞吸水)。
溶液浓度变大,反之,ψ细=ψπ+ψρ>ψπ(溶)时,则细胞中水份流向溶液中(即细胞失水)。
溶液浓度变小,若细胞的水势等于溶液的渗透势,即ψ细=ψπ+ψρ=ψπ(溶),则两者间水分没有净流动,即水分处于动态平衡,所以外界溶液浓度不变。
此溶液的渗透势即等于植物的水势(ψ细=ψπ(溶))。
3.2.1小液流法:
小液流法即是依据溶液浓度不同其比重也不同的原理来找出植物组织处于水分平衡时的溶液浓度,然后根据公式ψπ=-RTiC计算出植物组织的水势。
3.2.2压力室法:
在正常情况下,因叶片蒸腾而使木质部的液流常处于负压。
当叶片从植株上剪下时,叶柄木质部内的汁液由于木质部的负压而被吸入(被大气压入)内部。
测定时把叶片放入压力室,而叶柄切口露在外面,通过高压瓶给压力室施加足够的压力,当叶柄木质部内的汁液逐渐被压回切口处时,所加的压力值约等于切取叶片前木质部的负压估计值,即为叶片水势的估计值。
3.2.3折射仪法:
利用折射仪测定溶液的折光率。
折光率的大小与溶液的温度和浓度有关,当温度一定时溶液浓度升高,折射率变大;
浓度降低,折射率变小;
浓度不变,折射率亦不变。
将待测植物放入系列浓度的外液中浸泡一定时间后测其折光率,从中找出浸泡前后折光率不变的溶液,其渗透势即为植物组织的水势。
3.2.4热电偶湿度计法:
在装有样品的密闭测定杯中,插入高灵敏度的热电偶湿度计,然后在热电偶环上滴加一定浓度的蔗糖溶液。
当样品水势低于糖液水势时热电偶环上的糖液失水,使温度略有下降;
反之,若样品水势高于糖液水势时热电偶环上的糖液得到水分,温度略有上升。
这种微弱的温度变化可通过热电偶转变为电压变化,再换算成水势值。
在实际测定时,选用接近样品水逝的几种蔗糖溶液测出输出电压,根据不同浓度糖液的水势值与输出电压的关系绘出直线图,找出输出电压为零时的水势值,此即样品的水势值。
测定植物水势的变化可作为诊断植物水分不足和确定合理灌溉时期的良好手段。
一、质壁分离法测定植物细胞的渗透势
4.1仪器设备
移液管、青霉素小瓶、试管、硅胶塞、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、刀片、显微镜。
5.1试剂
5.1.1含有花青素的洋葱鳞茎的表皮细胞或蚕豆叶片等;
5.1.21mol•L-1蔗糖溶液。
6.1操作流程图:
蔗糖梯度溶液配制→植物组织细胞处理→制片观察→分析计算结果
7.1实验步骤:
7.1.1用1mol•L-1蔗糖溶液配制0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6mol•L-1的蔗糖溶液各10ml。
各溶液分别装入具塞子试管中,按浓度梯度递减的次序排成一行,并在试管壁上注明浓度的标签。
各浓度溶液分别吸取3ml分装在具塞子青霉素小瓶中,小瓶上同样标记好浓度标签。
7.1.2从带有花青素的洋葱鳞茎撕取外表皮,从高浓度开始,每隔一定的时间(5min)依次向浓度递减的蔗糖溶液中迅速浸入4~5片表皮(约1*1cm2),使其完全浸入。
.
7.1.3在蔗糖溶液中浸泡15~25min左右,从0.6mol•L-1开始依次取出表皮放在滴有同样浓度溶液的载波片上,盖上盖玻片,在显微镜下观察各种溶液中表皮细胞的质壁分离的情况,如果在两个相邻浓度的蔗糖溶液中,一个开始有质壁分离的现象(30%细胞在角隅上有初次质壁分离),而另一个没有,我们就可以初步确定细胞的渗透势与这两个溶液浓度平均值的渗透势相等。
例如:
溶液浓度(mol•L-1)
材料在溶液中浸泡的时间
观察时间
观察结果
0.5
2:
00
25
显著质壁分离
0.4
02
27
在角隅上分离(30%左右)
0.3
03
28
没有质壁分离
那么与细胞液等渗的浓度大致就在0.3~0.4mol•L-1之间。
7.1.4在找到上述浓度时,用新的溶液和新鲜撕取的外表皮重复进行一次,直到有把握为止。
并按下列公式计算在常压下该组织细胞液的渗透势。
ψπ=-RTiC(MPa)
ψπ表示渗透势,单位(MPa);
R表示气体常数:
0.08314L•MPa•(mol•K)-1;
T表示绝对温度,K即273℃±
t(实验时温度);
i表示等渗系数,蔗糖等于1;
C表示等渗溶液的克分子浓度(mol•kg-1)。
7.1.5观察项目及结果分析:
将结果记录在下表中,并计算出细胞的渗透势。
蔗糖克分子浓度(mol•L-1)
渗透势(MPa)
质壁分离情况
细胞的渗透势
0.6
0.2
0.1
7.1.6实验时应注意的问题:
7.1.6.1配制蔗糖溶液一定要准确,盖上塞子摇匀。
7.1.6.2实验材料一定要完全浸入蔗糖溶液,在浸泡过程中应适当摇动。
二、植物组织水势的测定——小液流法
4.2仪器设备
大试管;
小试管;
硅胶塞;
青霉素小瓶;
毛细移液管(尖端弯曲);
移液管(5ml、10ml);
钻孔器;
镊子;
木版;
试管架。
5.2试剂
5.2.1叶子(女贞、何首乌、油菜、菠菜或其他植物叶片)和马铃薯块根;
5.2.21mol•L-1蔗糖溶液、亚甲基蓝。
6.2操作流程图:
配制浓度递减的蔗糖溶液→取材浸泡→着色观察→记录→分析计算结果
7.2实验步骤:
7.2.1首先在大试管中配制一系列浓度递减的蔗糖溶液(0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6mol•L-1)各10ml(和质壁分离实验共用)。
取上述溶液3ml注入小青霉素瓶,各管都塞好塞子,并编号(此为第一组试管),摇匀。
然后再取上述溶液各吸出3ml放入指形管中。
7.2.2用钻孔器从已清除表面灰尘的块根或叶子上钻取(或剪成)大小相同的小块,每一小瓶中放数片圆片(需量相等,约5片左右),塞好塞子,放置20min,在这段时间内摇数次,务必使叶片浸入溶液中。
7.2.3到时间后依次取出叶圆片,弃之,再向每一小瓶中各加少许甲烯蓝,溶解后,把已着色的溶液装入毛细管(方法是用拇、中指持毛细管,插入有色溶液中,待溶液柱已达3~4mm时,用食指紧按住毛细管的上端,慢慢取出毛细管)。
将毛细管壁上黏附的溶液用干净滤纸擦去。
然后将毛细管浸入指形管相应的溶液中,使毛细管的尖端位于溶液的中部,然后自毛细管中心缓慢地放出少量蓝色溶液,并观察放出的小液流移动的方向,按此法从低浓度到高浓度一种一种的做。
7.2.4如果小液流向上移动,说明溶液从细胞液中吸取水分而被冲淡,比重比原来低,如果小液流向下移动,则说明实验溶液的浓度未起变化,即植物组织的水势等于溶液的渗透势。
记录小液流不动的那个试管的蔗糖溶液浓度。
初步得出水势所在范围后,为了精确地求出材料水势,可配制浓度差更小的一系列溶液,按上述方法再做第二次(或更多次)。
(本实验不进行)
7.2.5观察项目及分析结果:
按ψ=-P(MPa)(P=iCTR)计算水势。
7.2.6实验时注意的问题:
7.2.6.1配置溶液浓度要准确、盖上塞子并摇匀;
7.2.6.2取材时要注意取材方向、部位、老嫩程度要尽量一致;
7.2.6.3叶园片在小青霉素瓶内放置的时间最好不要超过25min;
7.2.6.4甲烯兰不可多放,否则会影响溶液比重;
7.2.6.5实验时温度要尽可能恒定;
7.2.6.6如果正确而熟练的掌握方法,小液流法可精确地测出0.002mol•L-1蔗糖溶液的浓度差,即相当于0.04个大气压。
附录:
一、冰点下降法测定植物细胞的渗透势(示范)
4.3仪器设备
4.3.1冰点下降测量计及贝克曼温度计;
4.3.2研钵或压榨器、烧杯、剪刀、小刀。
5.3试剂
5.3.1洋葱或其他植物的组织;
5.3.2冰、食盐。
6.3操作流程图:
调整温度计→加入混合剂→上样→密闭冰点下降测量计→测量记录→分析计算结果
7.3实验步骤:
7.3.1按贝克曼温度计的使用手册调整温度计,并测量纯水的冰点t1(重复2~3次,取其平均值)。
7.3.2将冰盐混合剂(冰:
盐=3:
1)倒入绝热容器内。
7.3.3将用压榨器压榨植物组织所得汁液5ml注入样品管中插入调整好的贝克曼温度计,并严格封闭。
7.3.4将上述工作完成后,插上插头,打开开关,使搅拌器不断搅动,温度开始下降,注意水银柱下降到最低点(由于过冷现象)的温度t2。
至液体接冰时,水银柱又慢慢回升,升至最高处(管内液体全部结冰)的温度t3。
重复2~3次,分别求出t2、t3的平均值。
7.3.5一般把t3-t1作为冰点降低值Δt,但测得的冰点降低值与过冷温度t2有关。
已知每过冷1℃所测得的冰点降低值Δt比真正的数值Δt'
大1/80,因此精确测定时应:
令t2-t1=δ
t3-t1=Δt
则Δt'
=Δt-δ/80
7.3.6结果分析:
ψπ=(22.4/1.86)*Δt'
=12.04*(Δt-δ/80)个大气压。
7.3.7实验时应注意的问题:
7.3.7.1要严格按照使用手册调整好贝克曼温度计。
7.3.7.2要严格密闭冰点下降测量计。
二、植物组织水势的测定——压力室法(示范)
4.4仪器设备
压力室水势测定装置、刀片、纱布或塑料袋、滤纸、瓷盘。
5.4试剂
带叶片的小枝或具木质叶柄的叶片。
6.4操作流程图:
取样→装样→加压测定→排气
7.4实验步骤:
7.4.1取样:
先从待测植株上切取带叶片的小枝或具木质叶柄的叶片,迅速用湿纱布包裹或装入塑料袋中以防止水分遗失,然后进行装测。
7.4.2装样:
将样品迅速插入橡皮室孔隙中,使切口露出密封垫圈几毫米,固定后放入钢筒中,旋紧螺旋环套。
为避免样品失水,可预先用湿滤纸条帖于钢筒内壁。
7.4.3加压测定:
将压力控制阀转向“加压”位,打开主控阀,以每秒0.5巴左右的速度加压,接近叶水势时,加压要慢些,以免加压过量。
当切口出现第一滴水珠时,马上关闭主控阀,读出加压值(叶水势值)。
可按下式换算成需要的单位:
1巴(bar)=0.987大气压=0.1兆帕(MPa)。
7.4.4排气:
将压力控制阀转向“排气”位,放气,压力表指针退回至零,扭动螺旋套环,取出叶片,进行第二个样品测定。
一般重复四次,取平均值。
7.4.5实验时注意的问题:
7.4.5.1加压所用气体为氮气,如用含CO2太多的气体,对细胞有伤害。
7.4.5.2钢瓶的搬运和使用要遵守钢瓶使用规定。
7.4.5.3要注意控制加压速度,否则回影响钢筒中的温度,并进而影响测定精度。
7.4.5.4用做压力室的钢筒一般为不锈钢,其厚度为5.0~10mm,依所需加压力确定。
三、植物组织水势的测定——折射仪法(示范)
4.5仪器设备
折射仪、恒温水浴、分析天平、具塞试管、试管架、打孔器(Ф0.5cm)、移液管、擦镜纸、滤纸、试剂瓶、烧杯。
5.5试剂
5.5.1叶片或其他组织部分;
5.5.21mol•L-1蔗糖溶液。
6.5操作流程图:
配制浓度递减的蔗糖溶液→对照溶液测定→取材浸泡→样品溶液测定→分析计算结果
7.5实验步骤:
7.5.1用1mol•L-1蔗糖溶液配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol•L-1的蔗糖溶液各10ml。
各浓度溶液分别吸取2ml分装在2组具塞子试管中,试管壁上同样标记好浓度标签,或将试管放在恒温水浴锅中,或在室温下自然平衡。
7.5.2用折射仪依次测定一组具塞子试管中糖液的折射率,做好记录。
7.5.3将被测叶片洗净吸干外附水分,避开大脉打取叶圆片(Ф0.5cm),在另一组具塞子试管中,每管加入7~10片叶圆片(视叶片含水量而定)完全浸入溶液中,盖上塞子摇匀。
30min后依次取出叶圆片,再用折射仪测定各管中液体的折射率。
7.5.4以两次测定时折光率未变的蔗糖浓度或相邻两管(折光率一个升高一个降低)浓度的平均值为等渗浓度,按照公式计算:
ψπ=-RTiC(MPa)
7.5.5实验时注意的问题:
7.5.5.1配置溶液浓度要准确、盖上塞子并摇匀;
7.5.5.2取材时要注意取材方向、部位、老嫩程度要尽量一致;
7.5.5.3叶园片在试管中放置的时间最好不要超过30min;
7.5.5.4注意折射仪的校准和仪器保管。
四、植物组织水势的测定——热电偶湿度计法(示范)
4.6仪器设备
热电偶湿度计测定装置;
恒温水浴锅;
低温冰箱;
1ml注射器(每种糖液专用);
试管;
剪刀;
纱布;
白瓷盘;
5.6试剂:
5.6.1植物叶片;
5.6.2按照下表配制不同水势的蔗糖系列标准溶液:
蔗糖液水势(MPa)
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
100ml水加入蔗糖克数
5.50
8.21
11.00
13.70
16.50
19.25
22.10
糖液浓度(mol•L-1)
0.161
0.240
0.322
0.401
0.483
0.563
0.646
6.6操作流程图:
测校正值→上样→加标准糖液→读数→渗透势测定→作直线坐标图→计算压力势
7.6实验步骤:
7.6.1装置:
将热电偶焊接在铜柱塞下端两条导线上,末端制成环状;
在铜柱塞上部安放一个塑料套筒,从中引出的导线接于微伏计或纳伏计上;
铜制固定管下端外套一橡皮圈,用于密封样品杯;
测定时整个装置放入恒温水浴锅中。
7.6.2样品测定:
7.6.2.1上样:
将样品紧贴于样品杯壁和杯底,迅速套上铜制固定管,并将与样品杯接口处用橡皮圈密封,置于恒温水浴(25℃)中。
7.6.2.2加标准糖液:
根据估计的样品水势,用注射器向热电偶环上加1滴适宜浓度的蔗糖溶液,迅速把热电偶插入铜制固定管中,使热电偶位于样品杯中部;
7.6.2.3读数:
每隔0.5h在微伏计或纳伏计上读数1次,如果前后2次读数之差不超过0.1μV时,即可更换另一种浓度的糖液。
通常,滴加第一种溶液约需2.5~3h方能达到平衡,而滴加第二、三、四种溶液时经0.5~1h便可达到平衡。
7.6.2.4渗透势测定:
上样后将样品杯密封,置于干冰中5~10min,以破坏细胞膜,待样品融化时进行测定,其方法与测水势相同。
7.6.3结果计算:
7.6.3.1测校正值:
每一热电偶都有一校正值,因此在使用前将热电偶洗净晾干校正(例如校正值为0.11μV),将所测输出电压(μV)减去校正值和仪器零点值,即得所加标准糖液的实际电压输出值;
7.6.3.2作直线坐标图:
以标准蔗糖溶液的水势和渗透势(兆帕)为横坐标,以相应的输出电压(μV)为纵坐标,找出各个点划出直线坐标图,该直线与横轴相交点(零电压处)即分别为样品的水势值(ψw)和渗透势值(ψs);
7.6.3.3计算压力势(ψp)根据公式ψw=ψs+ψp计算之。
7.6.4实验时注意的问题:
7.6.4.1测定时所选用的几种标准蔗糖溶液要使热电偶的输出电压有正有负,并且分布于横轴(零电压)附近。
以便尽量减小误差。
7.6.4.2测样前热电偶必须校正。
7.6.4.3每次更换糖液时要用脱脂棉吸净热电偶环上的糖液。
8.参考文献
8.1张志良,瞿伟箐主编。
植物生理学实验指导。
高等教育出版社,2003
8.2中国科学院上海植物生理研究所等主编。
现代植物生理学实验指南,科学出版社,1999
8.3朱广廉等主编,植物生理学实验,北京大学出版社,1990
8.4上海植物生理学会编。
植物生理学实验手册,上海科学技术出版社,1985
8.5白宝璋汤学军主编。
植物生理学测试技术,中国科学技术出版社,1993
8.6李合生主编。
植物生理生化实验原理和技术,高等教育出版社,2001
8.7薛应龙主编。
植物生理学实验,高等教育出版社,1990
9.推荐读物
9.1《植物生理与分子生物学学报》中科院上海植物生理生态研究所主办双月刊
9.2《生物工程学报》中国科学院微生物所主办双月刊
9.3《植物生理学通讯》中科院上海植物生理生态研究所主办双月刊
9.4《植物学通报》中国科学院北京植物所主办双月刊
10.思考题:
用小液流法测定植物组织的水势和用质壁分离法测定植物细胞的渗透势都是以外界溶液的浓度计算出溶液的渗透势为依据,它们之间有何不同?
11.推荐网站
生物系专业系统实验
(二)——植物生理学部分
掌握植物溶液培养的方法以及溶液培养技术在确定植物营养需求研究方面的应用。
本实验通过溶液培养的方法了解植物根系对磷元素的动态吸收过程和学习磷的测定方法。
掌握溶液培养和植物根系对磷的动态吸收的原理和方法。
磷是植物正常生活的必需元素,是许多有机磷化物(磷脂、核苷酸、核蛋白)的重要组成部分。
在体内物质和能量代谢中起着极为重要的作用。
本实验是用溶液培养法,培养七日龄的玉米幼苗,再用测磷的铜蓝法测出培养玉米幼苗前和培养一定时间后,培养液的磷量,计算出玉米幼苗一定根(重量)量,一定时间(一天)内从溶液吸收的磷量吸收量=(培养前培养液的磷量—培养一天后培养液中的磷量)/[根鲜重(mg)*t(1天)]
一、植物的溶液培养
溶液培养是研究矿物质营养的重要方法之一。
近年来,在特殊情况下,也用来培养蔬菜、藻类、花卉等(即无土栽培法)。
植物正常生长发育必需要各种矿物质元素。
当缺乏某种必要元素时,植物的正常生长过程便会受到不同程度的破坏,表现出元素缺乏症。
本实验是了解主要的几种矿物质元素N、P、K对植物生长发育的重要性和必要性。
(一)、植物缺乏必要元素的症状
3.1实验.原理
绿色植物的正常发育需要一定种类的矿质元素,只要满足植物生长发育所需要的矿质元素和其它条件(适合的渗透势、PH值、通气条件)。
植物不一定非要在土壤中才能生长。
因此,在蒸馏水及必须的几种矿质元素配置成的培养液中,经常通气,植物同样可得到正常地生长发育,这种培养的方法称为溶液培养。
(如把培养液加于清洁的石英砂中来培养植物,则称为砂基培养)。
由于溶
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