神经干细胞的分离与培养文档格式.docx
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CPBS(pH7.4)漂洗,解剖显微镜下剥离脑膜,切取大脑皮质,用手术刀片将组织切碎,加入少量基础培养液,经200目尼龙网滤过,1000r/min离心10min收集细胞,细胞重悬于含B27和20ng/mlbFGF的DMEM/F12培养液,以2´
105个细胞/ml接种于玻璃培养瓶,37°
C5%CO2培养。
培养4d后,离心收集未贴壁生长的细胞克隆,更换新鲜培养液,稍加吹打分散成小细胞团,再培养4d后重复此步骤一次,以后每5~7d传代一次,传代采用200目不锈钢网机械法分散细胞。
1.2.2神经干细胞的鉴定
自新能力的鉴定:
单克隆化培养的细胞球,加入5mmol/LBrdU培养7d,经4%多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后,用抗BrdU抗体进行免疫荧光染色。
nestin表达的鉴定:
培养2~3月的细胞经4%多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后,用抗nestin抗体进行免疫荧光染色。
多向分化能力的鉴定:
将培养的细胞球接种于内置盖玻片的培养皿,在所用的培养基中,加入1%胎牛血清或50ng/mlBDNF,培养至第7天用4%多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后,采用不同神经细胞特异性抗体进行免疫荧光染色鉴定。
分别用抗MAP2抗体鉴定神经元,用抗GFAP抗体鉴定星形胶质细胞,用抗CNPas抗体鉴定少突胶质细胞。
经鉴定证实培养的确为神经干细胞后,方用于底物作用的实验。
1.2.3不同底物对神经干细胞分化的诱导将洗净的盖玻片分别用多聚鸟氨酸(40mg/ml)、层黏连蛋白(10mg/ml)、多聚鸟氨酸(40mg/ml)+层黏连蛋白(10mg/ml)、鼠尾胶原(10mg/ml)进行包被。
多聚鸟氨酸的包被:
将洗净的玻片插在玻片架上,浸入含有多聚鸟氨酸的0.1mol/L硼酸缓冲液中,于室温包被3~4h,用去离子水漂洗5min共三次,置超净台内自然晾干,紫外线照射30min灭菌后使用。
层黏连蛋白包被:
将层黏连蛋白溶液滴在洗净已灭菌的玻片上,室温作用1h,将该溶液吸去后即接种细胞。
多聚鸟氨酸+层黏连蛋白包被:
于细胞接种前1h,将10mg/ml层黏连蛋白溶液滴在已经用多聚鸟氨酸包被并灭菌的玻片上,室温作用1h,将该溶液吸去后即接种细胞。
鼠尾胶原的包被:
将鼠尾胶原滴在洗净的玻片上,5min后吸去,覆有薄层鼠尾胶原的玻片置超净台过夜晾干,用紫外线照射30min灭菌后使用。
取体外培养3~4个月的呈神经球样生长的神经干细胞,稍加吹打分散后,接种于含不同底物包被玻片的培养板中,共为5组:
多聚鸟氨酸、层黏连蛋白、多聚鸟氨酸+层黏连蛋白、鼠尾胶原和空白对照组。
用1ml含B27和20ng/mlbFGF的DMEM/F12培养液(不含其他分化诱导剂)继续培养7d,每日观察细胞分化和迁移的情况。
1.2.4细胞的免疫荧光染色鉴定将各组细胞用4%多聚甲醛+0.3%戊二醛固定30min,PBS漂洗三次,用含5%正常山羊血清的PBS在室温条件下封闭30min。
分别用抗MAP2抗体(1:
100稀释)、抗GFAP抗体(1:
1000稀释)、抗CNPas抗体(1:
200稀释)于室温反应3h;
经漂洗后,用荧光标记的二抗于室温染色45min。
荧光显微镜下观察、拍照。
2结果
2.1神经干细胞的鉴定上述体外培养的细胞呈神经球样生长,干细胞鉴定指标表明,培养的细胞具有自身复制的能力,nestin表达阳性,经添加1%小牛血清或BDNF诱导24h后,即可见到细胞团贴壁,各种不同形态的细胞从细胞团中长出,2~3d后,表现出明显的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的形态特征,诱导分化第7天的特异抗体免疫染色结果可见有三种神经细胞的特异染色,表明所培养细胞为神经干细胞[8]。
2.2底物对神经干细胞分化的诱导培养的神经干细胞球在未经包被的玻片上接种后5d内未见细胞分化(Fig1),约10d方可见个别细胞球贴壁,其周边仅出现少量分化样的细胞向外生长,绝大部分神经球未见贴壁与分化。
而培养于各种底物包被玻片上的神经干细胞球,在接种的第2天即可见许多细胞球贴壁生长,继而出现部分神经干细胞的分化,成为形态各异的神经细胞。
其中接种于多聚鸟氨酸+层黏连蛋白包被玻片上的细胞球分化最为明显,接种后1d所有的细胞球均已有分化的细胞出现,4~5d后大量神经干细胞出现分化,自神经球向周围生长(Fig2),1周后原有的神经球结构逐渐消失。
根据每日计数的分化干细胞球数和分化的细胞数,诱导神经干细胞分化的能力为层黏连蛋白>
多聚鸟氨酸>
鼠尾胶原。
经免疫荧光染色结果显示,底物包被的各组均可见到分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,Fig3A,B,C所示为多聚鸟氨酸+层黏连蛋白诱导的三种细胞免疫荧光染色结果。
多聚鸟氨酸+层黏连蛋白组分化成神经元的数量较其他组为多,占分化细胞的1%~2%,其他各组分化的神经元数量均不超过0.5%。
2.3底物对神经干细胞迁移能力的影响在单独多聚鸟氨酸或层黏连蛋白包被底物上分化的细胞,基本上仍然沿神经细胞球周边呈圆形分布生长,随着培养时间的增加,有一部分细胞可迁移至稍远处,在神经干细胞球半径3~4倍的范围内生长(Fig4A,B);
而在多聚鸟氨酸+层黏连蛋白底物上,分化后的细胞呈均匀散在分布,可迁移至远离神经干细胞球的位置生长(Fig2)。
以鼠尾胶原作为底物分化的细胞则基本上围绕细胞球的周边,通常在神经干细胞球半径2~2.5倍范围内生长,而且细胞质较丰富,细胞之间连接较紧密(Fig4C),1周之后,虽有少量细胞逐渐向外围迁移,但迁移距离远不如其他底物组。
3讨论
定向诱导分化是神经干细胞研究的重要内容,在体外培养系统中采用不同促分化剂诱导神经干细胞的分化,对于了解神经干细胞的分化机制以及明确定向分化条件,具有重要意义。
体外培养的神经干细胞分化受到诸多因素的影响,其中可增加细胞黏附性的一些底物与神经干细胞分化间的关系很值得探讨。
在神经细胞培养时,通常需用一些底物包被培养器皿以增加细胞的黏附性,并能促进细胞突起的生长和发育。
本实验提示这些常用于神经细胞培养的底物均能诱导神经干细胞的分化,它们在神经干细胞分化中所起的作用值得重视。
既往许多文献报道的研究都是将神经干细胞培养于包被多聚鸟氨酸(或多聚赖氨酸)的器皿,检测某些生物因子或药物能否诱导神经干细胞分化或定向分化,往往忽略了底物本身诱导分化的作用,由于所包被的底物本身即可使得许多神经干细胞出现分化,因此首先要明确它的作用以及它与诱导剂间的关系,否则容易造成对研究结果判定的偏差。
本实验结果表明上述这些底物均有促神经干细胞分化的作用,而且影响分化细胞的迁移能力有所不同,但这些底物如何影响神经干细胞分化和迁移能力以及它们之间协同作用的分子机制,目前仍然不清楚,有待深入探讨。
Whittemore等研究表明采用不同促分裂原和不同底物分离的中枢神经前体细胞的增殖能力及分化表型的可塑性有明显不同[9]。
有学者利用少突胶质前体细胞所做的研究提示,多聚鸟氨酸促迁移能力较基质胶(matrigel)强,而多涎酸基神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)高表达的细胞迁移距离较远,这种能力能被生长因子所增强[10]。
文献也表明层黏连蛋白-1的a链通过与质膜蛋白(plasmalemmalprotein)LBP110结合能促进神经嵴来源的前体细胞发育成神经元[11]。
这些研究结果也都证实了细胞外基质等底物的作用,但它们对神经干细胞分化以及分化后细胞迁移能力的影响,尚未见系统的研究。
因此明确底物这些作用的机制和它们与促分裂原及促分化因子等之间的关系,有助于了解神经发育和神经干细胞分化的诱导机制,为制定神经干细胞移植治疗的策略和创造神经干细胞分化的微环境提供借鉴。
目前,我们正在就这些研究内容做进一步的探讨。
长期以来,人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖,属于终末分化细胞。
因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复,神经功能的重建被视为几乎不可能。
神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功,为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
1、神经干细胞的定义
1989年,Temple等从13天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培养,发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞。
其后从成年鼠纹状体、海马齿状回等处分离出能在体外不断增殖,并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞群。
20世纪90年代后,许多实验都证实,人脑内也同样存在神经干细胞。
目前得到普遍认可的神经干细胞的概念是由Mckay在1997年提出的:
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。
2、神经干细胞的特点
神经干细胞具有的特点有:
①有增殖能力。
②有自我维持和自我更新能力,对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞,不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞,另一个为祖细胞,祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。
③具有多向分化潜能,在不同因子下,可以分化成不同类型的神经细胞,损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。
总之,自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。
3、神经干细胞的标志
1990年,Lendahl的实验证实,神经干细胞的标志蛋白是神经上皮干细胞蛋白(nestin)[19].Nestin在神经胚形成时开始表达,随着神经细胞的迁移和分化的完成,Nestin的表达量逐渐下降甚至完全停止。
目前,Nestin已被用于神经干细胞的鉴定。
4、神经干细胞的分布
在哺乳动物的胚胎期,神经干细胞主要分布在大脑的皮层、纹状体、海马、室管膜下层和中脑等区域。
正常哺乳动物成年后,中枢神经系统仍有神经干细胞存在,只不过这些细胞平时处于静止状态。
成年脑区神经干细胞主要局限在海马齿状回、纹状体和环绕侧脑室的室脑膜下层。
5、神经干细胞的分化、增殖及其影响因素
5、1生长因子:
研究表明,生长因子对从神经干细胞到最终形成神经系统的各类细胞(小胶质细胞除外)有连续影响。
FGF-2(碱性成纤维细胞生长因子-2)在胚胎早期维持神经祖细胞的的生存,促进其增殖。
ECG(神经表皮生长因子)在发育较晚期促使神经祖细胞增殖和分化。
FGF-2对神经元及胶质细胞的祖细胞都有促分化作用,而ECG仅对胶原祖细胞起作用。
BDNF(脑源性神经营养因子)、IGF1(胰岛素样生长因子1)主要促进祖细胞向神经元方向分化。
5、2细胞因子:
细胞因子对神经系统尤其是间脑细胞发育和成熟的作用越来越受到重视。
已发现许多细胞因子,如红细胞生成素、集落刺激因子、白介素家族等,并证明其影响神经元的发育。
BMP(骨架多型性蛋白)促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化。
5、3移植区域的信号:
Meltzor等认为在神经干细胞及神经祖细胞的发育过程中外源信号,尤其是所接触部位的外源信号的影响导致神经干细胞、祖细胞分化为与所移植区域相类似的细胞。
外源信号的作用分两种:
一是选择性调控,即信号只能调节干细胞的存活和增殖而不能影响其分化方向。
二是指导性作用,指特异性指导神经干细胞、祖细胞向特定谱系分化。
如皮层区的信号可以诱导神经干细胞分化为锥体细胞和星形胶质细胞形态相似的细胞;
来自纹状体区域的信号可以诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元;
脱髓鞘白质区域移植神经干细胞后可大量向少突胶质细胞分化。
5、4神经干细胞和神经祖细胞自身产生多种调控信号:
神经细胞发育的多样性可能与神经干细胞表达多种多样的转录因子有关。
不同的转录因子的表达导致不同譜系的分化。
如Nurrl激活,与位于酪氨酸羟化酶(TH)基因启动子区的反应元件相结合,是使神经干细胞向多巴胺能神经元定向分化的机制之一。
有报道人神经干细胞体外增殖后,种人不含附加因子、无血清的基础培养基中可分化成中枢神经系统不同细胞类型,与在含血清的基质中分化情况类似,提示人神经组细胞可能释放内源性因子来调节细胞分化。
5、5Nestin基因和Notch基因:
人nestin基因第二个内含子中存在一个(〈400bp区域〉对神经干细胞起增强作用。
这个增强子也对早期神经干细胞其他基因表达起作用,包括Notch基因。
Notch基因是在中枢神经系统发育过程中确定神经元数量的重要调控基因。
6、神经干细胞的应用
使损伤或病变的中枢神经组织恢复相应的功能是人类多年来一直未能解决的治疗难题。
神经干细胞的发现为神经损伤和脑退行性变的治疗提供了可能的途径。
目前,神经干细胞在应用方面的研究主要集中在以下两方面:
6、1神经干细胞移植神经干细胞移植已在多种动物模型上进行了研究。
Brustle等把体外扩增的人胚神经干细胞植入大鼠胚胎脑室,发现这些细胞与宿主组织细胞整合并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
LiangPeng等将人胚神经干细胞移植到脊髓横断大鼠的病变区域,3个月后,观察到横断处神经细胞轴突出现再生,运动功能部分恢复。
6、2以神经干细胞为载体的基因治疗把中枢神经系统的先祖细胞或神经细胞分离出来,导入外源性原癌基因,可以在体外建成细胞系,即形成所谓永生祖细胞系或干细胞系。
永生化神经干细胞系可在体外长期大量增殖,同时可被转染并在宿主体内稳定表达外源基因,将这些细胞植入损伤的神经系统可作为基因治疗的新策略。
Martinez-serrano建立了含有神经生长因子(NGF)基因的永生化神经干细胞系,这些细胞不但能在体外分泌NGF,在移植到动物脑内后,同样能表达NGF,并对其周围胆碱能神经元有促生作用。
这为治疗神经退行性疾病提供了可能的方法。
神经干细胞及其研究进展
神经干细胞(neuralstemcell,NSC)是指分布于神经系统的、具有自我更新和多分化潜能的干细胞。
其主要功能是作为一种后备贮备,参与神经系统损伤修复或细胞正常死亡的更新。
20世纪最后十几年来神经生物学领域内最重要的进展之一,就是发现了成年脑组织内确实存在有多能干细胞(即神经干细胞不仅存在于胚胎时期,也存在于成年动物的中枢神经系统,它们有着类似于皮肤和造血系统内干细胞的功能)。
巢蛋白(nestin)是目前作为识别神经干细胞的重要标志蛋白,巢蛋白阳性细胞具有干细胞的特征。
今天,科学家普遍相信,无论是胚胎还是成年脑内都有可分裂的干细胞,它们能够生成更多的神经干细胞包括神经祖细胞(progenitor)和神经元及胶质前体细胞(precusor),神经前体细胞再分化成各类神经元;
而胶质前体细胞则分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞。
在正常情况下,神经前体细胞不会演变成为胶质细胞,胶质前体细胞也不会演变成神经元。
然而,存在于胚胎或成年中枢神经系统内的干细胞,在特定信号和脑组织三维环境作用下,却可以发育成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。
由于神经干细胞可望成为补充因损伤、衰老而丧失的神经元或胶质细胞、提供一种替代来源,致使该领域的研究如雨后春笋,倍受关注。
一、成年脑的神经干细胞
研究首先从纹状体培养出干细胞样的中枢神经系统的多潜能细胞,它们来自室下带;
类似的细胞也来自其他成年还可能生成神经元的区域——海马齿状回;
此外,有些曾被认为是不可能在成年再生成神经元的地方,包括脊髓、隔区和纹状体的实质及小脑大脑皮层也分离出了多潜能的干细胞。
成年的少突胶质前体细胞首先从培养视神经获得,后又从中枢神经系统其它部位中分离出来,如小脑和脊髓。
小脑表明,干细胞在成年中枢神经系统的广泛区域都存在。
最近还发现,成人脑内也存在神经元前体细胞。
研究发现,成年脑虽具有生成新神经元的可能,但主要限于海马齿状回和嗅球。
由于在这两个区域产生的是新神经元,所以它们必然是来自有限的神经元祖细胞而非多潜能的干细胞。
齿状回产生的祖细胞,在成年动物中就位于齿状回内部;
而产生嗅球颗粒细胞核团周围神经元(periglomerularneurins)的成年祖细胞,则位于侧脑室最前部位的室管膜(subependyma)内,靠一种神经细胞粘合分子(neuralcelladhesionmolecules,N-CAMs)丝裂原,神经诱向因子等的作用,迁移到嗅球。
构成成年脑组织的神经元和胶质细胞均来自神经管直接衍生的胚胎神经上皮细胞。
这些细胞位于胚胎脑室腔的表面,组成脑室带(ventricularzone);
随着胚胎发育,室带中的某些细胞深入脑组织,组成室下带(subventricularzone),到了成年就形成了室管膜细胞。
研究证明,室管膜细胞与神经球细胞有关;
成年前脑的室管膜至少含有两种细胞:
持续增殖的细胞和相对静息状态的细胞,后者还有可能是前者的补充;
有人认为,静息状态的室管膜细胞更可能是在体外培养下形成呈集落状的神经干细胞,说明体内的相对静息的室管膜细胞与体外培养、形成小球的神经干细胞是一回事。
生长因子能够在体外使神经干细胞繁殖形成集落,在体研究(脑室注射神经生长因子)也证明生长因子除能使成年室管膜细胞数量扩大外,还可使新生成的室管膜细胞从侧脑室壁迁移到邻近部位(如皮质、纹状体和隔区)的软脑膜上。
提示加入外源性生长因子对使用胚胎脑组织细胞或基因工程细胞移植治疗脑损伤具有重要意义。
二、胚胎神经干细胞
(一)胚胎神经干细胞的来源及发育模式
中枢神经系统的神经干细胞来源于囊胚期的内细胞群,至少分两类,即神经上皮干细胞和神经球干细胞,前者依赖成纤维生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)发育分化,后者依赖表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)发育分化。
因此有学者也将神经系统的两类干细胞分别称为FGF依赖神经上皮(Neuroepithilia,NEP)细胞和EGF依赖神经球干细胞。
1992年,Reynolds首先报导神经球干细胞的存在,之后在猴、猪、狗、人、小鼠的各个脑区均发现有神经球干细胞;
这些细胞依赖EGF而发育;
有自我更新能力和产生神经元、少突胶质细胞及星形细胞的多分化潜能。
另一类存在于CNS的干细胞是FGF依赖神经干细胞,它同样具有自我更新和多向分化的能力。
两类干细胞均可进一步分化过渡形成多种中间型限制性前体细胞,包括:
限制性神经前体细胞(neuroal-restrictedprecusors,NRPs),限制性胶质前体细胞(glia-restrictedprecusors,GRPs),少突胶质细胞2型星型细胞(oligodentrocyte-type2astrocytes,O2AS),星形胶质前体细胞(astrocyteprecusorcells,APCs)以及周围神经系统的前体细胞即神经嵴干细胞(neuralcreststerncells,NCSCs)。
尔后,各类限制性前体细胞分别形成相应的靶细胞群。
(二)神经干细胞发育的时限性
胚胎神经干细胞主要来源于胚胎E10期左右的单层神经上皮,这些上皮细胞就是祖细胞。
脑的神经干细胞源于胚胎E10的祖细胞的皮质神经上皮;
它们分化为两种细胞:
成神经细胞或成胶质细胞。
以后,成神经细胞于胚胎期分化形成神经元,而胶质细胞在胎儿生后才分化完成。
即神经元和胶质细胞发育有明显的时间分隔特性。
神经干细胞于胚胎12天开始出现,15天达高峰,以后逐渐终止分化,至出生时基本完成。
而胶质发生的高峰出现在神经发生基本完成之后。
Jacobson的报导也证实神经元发生在胚胎期,而胶质细胞发生在出生以后(如大脑皮的星形胶质细胞在E16可首先被探测到,而少突胶质细胞呈现在出生时,但大量的胶质细胞主要被产生于生后的头一月)。
他们认为这种时空分隔可能有利于神经网络的形成(如神经元可在胶质细胞之前得到充分分化形成较长的突起。
以后胶质细胞再充填于神经网络之间)。
至于什么因素造成神经和胶质细胞的分化尚不清楚。
有人推测,早期发育神经细胞产生的成纤维细胞生长因子2(fibroblastgrowthfactor2,FGF2)可能在促进神经元和胶质细胞分化过程中起重要作用。
现已清楚,在体外培养的神经干细胞内添加如睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF),FGF2,血小板源性生长因子(platelet-derivedneurotrophicfactor,PDGF),骨形态相关蛋白(BMPs)可促进胶质细胞发育。
三、神经干细胞的特性及表面特征
由于体外证实神经上皮干细胞依赖FGF发育分化,而神经球干细胞依赖EGF发育分化,因此,CNS神经干细胞从开始可能就有不同的发育特性。
继而形成相应的各类前体细胞,从而决定了最终的分化方向和所要形成的靶细胞。
两类神经干细胞各具特性如下表示:
EGF依赖神经球细胞
FGF依赖神经上皮干细胞
生长方式
悬浮式生长
贴壁生长或悬浮生长
发生时间
出现在胚胎发育后期(E14,5天后,小鼠)
出现在胚胎发育中期(大鼠E10,5,小鼠E8,5)
依赖生长因子
依赖EGF发育
依赖FGF发育
表达受体
表达EGFR
不表达EGFR
分布
脑区,在脊髓无EGF依赖神经球出现,发育期
整个发育期脊髓均有FGF依赖干细胞
产生细胞
不产生神经嵴和PNS细胞
产生PNS和神经嵴细胞
分化速率
慢
快
此外,各类限制性前体细胞还具不同的表面抗原特性。
四、神经干细胞的分布与定位
最近才证实,胚胎脑内的干细胞的确可以形成全部脑内神经元和星形、少突胶质细胞。
哺乳动物胚胎脑中的神经干细胞主要位于七个部位:
嗅球、侧脑室脑室带(室管膜上皮)、脑室下带、海马、脊髓、小脑(后脑的一部分)和大脑皮质。
在不同物种之间,上述部位细胞的形态和数量颇有不同。
人们认为,位于不同部位的神经干细胞可能属于不同干细胞的群体,而非同一类干细胞分
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