环境消毒方法及效果的验证Word格式.docx

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药品生产时由于在洁净室的地面、墙面、顶棚、机器、人体及衣服表面可能有活微生物粒子存在，当温度、湿度合适时，细菌即在这些表面繁殖，并不时被气流吹散到室，因此洁净室（特别是无菌室）一般不安排三班生产，每天必须有足够时间用于清洁、消毒。

消毒和灭菌是两个概念。

灭菌（Sterilization）、除菌（Disinfection）和消毒（Sanitization）这三个经常被误用的词必须加以区别。

灭菌和除菌是绝对化的术语。

灭菌是指杀灭或不活化所有生命形式；

除菌则是破坏或不活化致病微生物的传染，但在应用于细菌孢子时往往无效。

灭菌法是对无菌制剂等生产过程中的灭菌，常用的方法有：

湿热灭菌法，可用无菌保证值SAL（SterilityAssuranceLevel）来表示效果；

干热灭菌法；

除菌灭菌法；

辐射灭菌法；

环氧乙烷灭菌法。

监测灭菌效果往往使用生物指示剂-----一种标准的对灭菌条件稳定的微生物。

而消毒可以说是减少微生物数量，使之达到安全或相对安全水平，而与使用规定和使用目的相符合。

抗微生物剂是一种用来抑制微生物繁殖或消灭微生物的试剂的总称，它包括：

⑴消毒剂能消除以细胞繁殖形态出现的微生物污染的化学试剂；

⑵灭菌剂杀灭在无生命环境的所有微生物生命形态的化学试剂；

⑶除菌剂用来消灭在无生命物体上的病原体的抗菌剂；

⑷杀菌剂可按具体作用分类：

杀细菌的称为杀细菌剂；

杀霉菌的则称之为杀霉菌剂；

杀病毒的则称之为杀病毒剂；

杀孢子的则称之为杀孢子剂；

⑸抑菌剂仅是抑制微生物生长的化学试剂。

因此灭菌和消毒是不可互换的术语，消毒剂在定义上也并不意味着是灭菌剂。

消毒是消灭来自繁殖形态的细胞的活微生物的污染，但它不保证灭菌。

（二）消毒剂的选择和配制

1．消毒剂的选择

在选择一种消毒剂时，首先要了解消毒剂的性质，但同时又应该认识到没有一种消毒剂是完全理想的。

细菌学家建议理想的消毒剂应该具备以下特征：

①能广谱地杀灭微生物；

②对人体无害；

③无腐蚀性，对设备无污染；

④具有洗涤剂作用；

⑤具有稳定性；

⑥作用迅速；

⑦不因有机物的存在而失去活性；

⑧产生所期望的后效作用；

⑨廉价。

各种试剂都有优点和局限性，应选择一种试剂或几种试剂结合使用，以最低成本获得最大效果。

2．无菌室常用消毒剂的配制

无菌室所使用的消毒剂应在净化工作台上配制，需过滤的应准备好已灭菌（122.1℃，45min）的滤膜及容器。

过滤好的消毒剂应在盛放瓶上注明消毒剂名称、批号、配制日期及失效期，放在无菌室中。

⑴75%酒精（Alcohol）溶液（体积分数）的配制

先用定性滤纸过滤95%的乙醇溶液，再将冷却的注射用水加到滤过的乙醇溶液中充分混合，直到酒精比重计读数为75%。

将配制好的溶液用0.22μm混合纤维素脂微孔过滤膜过滤后，放入已灭菌的瓶中待用。

此溶液须在48h使用。

⑵0.1%（体积分数）新洁尔灭（DodecyDimethylBenzylammoniumBromide，DDBB）溶液的配制

在49ml的注射用水中加入1ml的5%新洁尔灭溶液并搅拌均匀，将配制好的溶液用0.22μm混合纤维素脂微孔过滤膜过滤后放入已灭菌的瓶中待用。

⑶Exspor溶液的配制

按注射用水∶Exspor基质浓缩剂∶Exspor活性浓缩剂为4∶1∶1（体积比）的比例混合并搅拌均匀。

注意次消毒剂须放在非金属容器中配制，注射用水温度用小于20℃。

将配制好的溶液用0.22μm混合纤维素脂微孔过滤膜过滤后放入已灭菌的瓶中待用。

此溶液须在72h使用。

⑷1%（体积分数）GermWarfare灭菌溶液的配制

在990ml注射用水中加入10ml的GermWarfare溶液并搅拌均匀。

⑸5%（质量分数）麝香草酚（Thymol）溶液的配制

在95g的50%乙醇溶液中加入5g麝香草酚并搅拌均匀。

此溶液不必过滤，但须在24h使用。

此消毒剂主要用来杀霉菌。

⑹2%（质量分数）戊二醛（GlutaricDialdehyde）溶液的配制

在250g的20%戊二醛溶液中加入注射用水至2500g，再加入1.3g缓冲剂并搅拌均匀。

（三）主要消毒和灭菌方法

1．干热法

是在干燥空气中加热处理的方法，基于高热作用下的氧化作用破坏微生物的原理，一般需要的温度高达160℃以上，时间长达1~2h。

2．湿热法

是用高温湿蒸汽（通常为饱和蒸汽）的灭菌方法，基于湿热作用下使细菌细胞蛋白质凝固的原理，一般需要的温度比干热法低，时间也短，例如121℃、12min或134℃、2min。

3．药物法

是用某种气体或药剂进行熏蒸或擦洗，其效果与药物种类及细菌对其敏感程度有关。

一些药物对一些材料有吸附侵蚀作用。

例如常用的氧化乙烯，是一种良好的灭菌剂，虽不能浸透固体，但可被塑料、橡皮之类吸收，这就需要根据洁净室的使用对象选用合适的材料。

但不要长期使用一种消毒剂，应定期更换，以防止耐药菌株的产生。

4．电磁辐射法

基于破坏细菌的蛋白质、核酸（脱氧核糖核酸，即DNA）以及被吸收后的热效应等原理。

紫外线灭菌就是这种方法之一。

5．紫外线消毒

在其他消毒方法未使用之前，是一个不可代替的必备的消毒方法，为药品生产企业普遍采用，主要用在洁净工作台、层流罩、物流传递窗、风淋室乃至整个洁净房间的消毒。

紫外线的杀菌力取决于紫外线的波长，短波具有杀菌力，长波可能对人体有害，所以它的使用受到限制。

紫外线波长为136~390nm，消毒用的紫外灯应限制在短波的波长围，以253.7nm的杀菌力最强，但由于制造长测定波长比较困难，故发展不快。

据国外最新研究表明，紫外线灭菌仍有广阔的前景，具有安装方便、无耐药菌株产生等特点，关键是解决短波的测定问题。

还有一种方法是采用气相循环消毒灭菌。

如果能让空气有组织地循环流过紫外灯的有效照射区，既增加了紫外线对空气的照射时间，而又设法不让紫外线外泄伤人，并且不产生臭氧，因此紫外线对空气的消毒作用就大大提高了。

6．臭氧消毒

臭氧（O3）的消毒原理是：

臭氧的常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，可氧化分解细菌部氧化葡萄糖所必需的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死。

多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧分子（O2），不存在任何有害残留物，故称无污染消毒剂。

臭氧不但对各种细菌（包括肝炎病菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌）有极强的杀灭能力，而且对杀死霉菌也很有效。

生产臭氧的原料主要是空气和电能，一般通过高频臭氧发生器（电子消毒器）来获得。

消毒时直接将臭氧发生器置于房间中即可。

空气中使用臭氧消毒的浓度很低，只有百万分之几，可根据房间体积及臭氧发生器的臭氧产量来计算得到。

7．气体消毒

对环境空气灭菌的传统做法是采用某种消毒液，在一定条件下让其蒸发产生气体来熏蒸。

常用的消毒液有甲醛、环氧乙烷、过氧乙酸、石炭酸和乳酸的混合液等。

8．消毒剂消毒

洁净室的墙面、天花板、门、窗、机械设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手（手套），在环境验证及日常生产时应定期清洁并用消毒剂喷洒。

常见的消毒剂有异丙醇（75%）、乙醇（75%）戊二醛、洁尔灭等。

我国药厂无菌室消毒的传统方法是用甲醛熏蒸。

国外因认为甲醛对人体有一定的危害，现普遍采用戊二醛（Glutaraldehyde）喷洒，起方法是将戊二醛放在带有时间控制的自动喷雾器中，在下班后或周末，无菌室无人时自动喷洒，其喷洒量可以调节，时间可以设定，在喷洒期间空调系统应停止工作。

二、效果的验证

清洁和灭菌是驱除微生物污染的主要手段，但必须保证清洁及灭菌的彻底性，因此药品生产企业必须制定清洁与灭菌规程，并定期进行验证，以确保清洁与灭菌的有效性。

清洁与灭菌往往是联系在一起的，总是在房间清洁之后再进行消毒，消毒结束后再次清洁。

对于环境消毒效果验证的容有：

消毒条件，方法，所用介质，清洁剂，灭菌剂及浓度，消毒设备，消毒时间以及最后的环境监测。

（一）消毒方法验证的要点

各种消毒方法均需用到消毒设备，因原理不同各有特点。

1．紫外灯消毒验证的要点

①紫外灯的杀菌力随使用时间的增加而减弱，若紫外灯使用超过平均寿命时，就达不到预期效果，则必须更换。

国产紫外灯平均寿命一般为2000h。

②紫外灯的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌时的照射量要比杀杆菌时大40~50倍。

③紫外灯通常按相对湿度为60%的基准设计，室湿度增加时，照射量应相应增加。

④紫外线强度要求在操作面上达40μW/cm2以上。

因此紫外灯消毒方法验证中紫外灯需确认的参数主要有紫外线的波长、紫外线强度、灯管的寿命。

此外，紫外灯消毒的效果照射的时间长短有关，这需通过验证来确定。

2．臭氧消毒验证的要点

臭氧消毒效果的验证中需确定和校正的臭氧发生器技术指标主要有臭氧产量、臭氧浓度和时间定时器，并通过最终检验细菌数来确定消毒时间。

（二）消毒效果的验证方法

各种消毒方法的效果需通过验证来得到证实。

比如说如何使用消毒剂？

喷洒法、烟雾法或者浸润法哪种更好？

接触时间需多长？

温度和PH值也是需估计的因素，因为它们能影响消毒的速度。

提高温度、降低PH值，有时能提高消毒剂的活性，但这取决于使用河种消毒剂。

消毒剂是否与被处理的表面相接触？

消毒剂残留存在的意义和给制造带来的污染的风险都是极端的重要考虑因素。

一般来说陶器、大多数玻璃和不锈钢能经受大多数化学消毒剂。

在选择一种试剂前必须有一个对生产区所用材料，如墙壁、天花板和地板涂层的相溶性及关于腐蚀性、玷污、气味等方面的研究。

在选择消毒剂及其使用方法时，比受处理材料表面特性更为重要的是被杀灭的微生物种类。

许多消毒剂只对特定的生物体（如对革兰阴性菌、霉菌等）有效，可发现有些菌种对消毒剂有抵抗力或极少受药剂的影响。

各种化学消毒剂获得最大效果的条件各不相同，但重要的影响因素包括：

①PH值；

②温度；

③湿度；

④使用稀释剂性质；

⑤浓度；

⑥有机物的存在；

⑦接触时间。

通常消毒作用随温度的升高而增强，因为其对微生物的作用犹如一个化学反应。

消毒剂可杀灭微生物，也可能只起抑制剂作用，这很大程度上取决于它的浓度。

提高消毒剂的浓度通常能提高其杀灭效果，但是某些稀释的消毒剂会被某些微生物代谢，例如假单孢杆菌菌种会对酚类化合物起氧化作用。

在评估消毒剂使用围时，应重视交替使用消毒剂。

由于事实上没有一种理想的消毒剂，所以考虑使用两种以上消毒剂是明智的。

交替使用消毒剂在理论上有利于防止形成相同环境的分离菌或抑制菌的适应性。

如果交替使用是必要的，就应该决定交替频率。

方法之一是当具体试验数据显示需要轮换时就及时轮换消毒剂，另外可采用到一定周期（每周或每月等）就轮换的方法。

常用的消毒效果验证主要有指示剂试验和表面污染试验等方法。

1．用生物指示剂进行细菌挑战性试验

生物指示剂（BI）菌种可选用枯草芽孢杆菌孢子，在使用前要测定其初期菌数，应不少于10个。

在消毒灭菌前，将装有BI表面皿置于各被测房间的中央地面，灭菌前打开表皿，灭菌结束后，回收BI放入大豆酪素消化液体培养基中，在37℃下培养3天，看细菌是否被杀灭。

若没有细菌生长，则为合格。

2．表面污染试验

表面微生物污染试验的方法只要有真空吸引法、培养皿接触法（RodacPlate取样法）、棉签擦抹法和浸渍法等。

⑴真空引吸法

使吸引喷嘴接近需检查的表面，随同空气吸引附着于物体表面的粒子，并用无菌的薄膜过滤器过滤，以任何方式进行培养，从而测得细菌的数量。

此方式在药品生产企业用得较少。

⑵培养皿接触法

培养皿接触法（RodacPlate法）最为简单，但仅适用于平的表面。

盘灭菌的琼脂（通常直径为50mm）直接与设备表面接触，然后加盖在预定时间和规定温度下（例如30～35℃或20～25℃）进行培养，用肉眼对微生物计数并识别，如必要还得鉴别菌种。

此方法要求将培养基倒入培养皿中并使之隆起，要做到这一点操作上比较困难。

⑶棉球擦抹法

这是一种简单可行的方法，为制药企业普遍采用。

消毒结束后，可对洁净室的机械表面、部及缝隙间、墙壁、窗台、试验台等表面的一定面积，用事先经过灭菌的生理盐水、精致水和缓冲液（例如磷酸缓冲生理盐水）润湿的适当大小的灭菌纱布或灭菌脱脂棉充分擦拭，然后放入广口瓶，加一定量浸出液振摇（或作超声波洗涤），再对浸出液进行菌的培养。

棉签取样能用于Rodac盘无法进行取样的场合，例如角落、缝隙等处。

棉签可以由棉花和涤纶制成。

如果棉签是由海藻酸钙做成的那就最好不过了，因为这种材料可溶于稀释液，这样便于将微生物释放在溶液中。

⑷浸渍法

棉签先用灭菌稀释液（如注射用水）湿润，然后擦拭取样区域，最后放入到一个装有经预测试的灭菌稀释液的试管中。

样品应尽快进行测试，以免在稀释液中增加微生物数量。

试管经搅动从棉签上释放出微生物，稀释液则注入培养基盘，经培养，然后计数并鉴别。

消毒效果验证实例

【示例1】甲醛气体熏蒸消毒的验证

1．甲醛消毒方法

在所有的消毒液中甲醛最为常用。

当相对湿度在65%以上、温度在24～40℃时，甲醛气体的消毒效果最好，但若采用过多的甲醛，会因聚合而析出白色粉末附着在建筑物或设备表面。

一般甲醛的消毒方法如下。

①消毒前先用丝绸浸注射用水擦洗房间建筑物表面和设备表面，然后用5%麝香草酚溶液喷洒和擦洗，静止1h后，再用丝绸浸注射用水再擦洗一次。

②计算体积（包括房间和风管体积），按10ml/m3的比例准备浓度为36%的甲醛溶液（甲醛密度约为1.1g/ml），按2～3g/m3的比例准备高锰酸钾溶液。

③在房间中放入试验装置，如不锈钢培养皿支架；

Φ90mm双碟玻璃培养皿；

枯草杆菌（TESPER-G）试纸，每试纸上枯草杆菌数量为1×

106个，每个培养皿中放两个试纸，1做无菌试验，1做含菌数试验。

培养皿的数量应根据房间面积确定。

④消毒流程：

在不锈钢容器中加入高锰酸钾，用双层纱布盖住桶口，再倒入36%浓度的甲醛溶液→甲醛气体扩散（约30min）→启动空调器让甲醛气体循环（约20min）→关闭通风系统，房间熏蒸消毒，时间不少于7h→房间排气，用新鲜空气置换（约2h）→开启空调系统→用75%酒精喷洒环境。

⑤质监部门取样培养。

判断标准：

试纸枯草杆菌数量小于1×

103个为合格。

⑥取样后用丝绸沾0.1%的新洁尔灭溶液擦洗机器表面；

用0.1%新洁尔灭溶液或1%GermWarfare溶液或75%酒精喷洒建筑物四周。

0.1%新洁尔灭溶液与1%GermWarfare溶液每月轮换一次，即三周用0.1%新洁尔灭，一周用1%GermWarfare。

2．气体熏蒸灭菌后室环境中残量的测试

用甲醛气体进行熏蒸灭菌后，需用全新空气换气若干小时，由于甲醛的环境标准只有（1～2）×

10-6，要使环境中残留的甲醛浓度尽可能低至不致使人嗅出特殊臭味＜0.55×

10-6，并对眼睛无刺激＜0.1×

10-6，然后根据测定的室环境中甲醛残留量结果，正确设定换气时间，以保证在达到作业环境中无菌的前提下，对人身心健康不致产生不良影响。

⑴取样方法及取样量

在各取样场所，用约30ml的塑料待收集室空气，将袋空气用由吸收瓶、泵、气流计等组成的装置捕集至瓶吸收液中（样本数应≥3）。

⑵供试液的配制

取0.5%硼酸溶液20ml作为吸收液，用溶液吸收法，以1L/min的速度分别让各取样场所的空气通过10min，然后将吸收液移至25.0ml的容量瓶中，加水使成25.0ml，即得。

⑶试验操作

①取供试液2.0ml至带栓试管中，加5mol/L的NaOH溶液2.0ml及AHMT溶液2.0ml，轻摇数次混匀后，室温放置20min。

然后加KIO4溶液2.0ml，摇2～5min至无气泡生成为止；

同时用水2.0ml同法制成对照液，在波长550nm附近测最大吸光度。

②分别取甲醛标准液0、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、，加水使成2.0ml，然后按①操作，测定吸光度，制出甲醛浓度（μg/ml）与吸光度的关系检量线。

环境中的甲醛浓度（10-6）可由下式求出：

22.4273+t

甲醛浓度（10-6）=a×

×

25×

30.03273V

式中a供试液中甲醛浓度，μg/ml;

V采样气体量，L；

t采样时平均温度，℃；

22.41mol气体在0℃、1个大气压（101.325Kpa）下的体积，L；

30.03甲醛相对分子质量；

25供试液全量，ml。

⑷试液准备

①甲醛标准液

a．甲醛稀释液：

精取中国药典中规定“甲醛溶液①”1ml，加水准确至200ml作为甲醛稀释液。

精取该液10ml至碘瓶，准确加0.1mol/L碘液50ml，再加1mol/L氢氧化锂溶液20ml。

避光放置15min后，加15ml的10%硫酸，用硫代硫酸钠液（0.1mol/L）滴定。

另用水10ml进行空白试验。

（VA-VB）×

1.5013

甲醛稀释液中的甲醛浓度（mg/ml）=

式中VA甲醛稀释液消耗0.1mol/L硫代硫酸钠液量，ml；

VB空白试验消耗0.1mol/L硫代硫酸钠液量，ml；

1.50131ml碘液（0.1mol/L）相对甲醛量，mg；

10甲醛稀释液取样量，ml。

b．甲醛标准液：

精取甲醛稀释液，加水准确稀释1000倍，即得。

②AHMT溶液

取4-氨基-3-肼-5-巯基-1，2，4-三唑0.5g,加0.2mol/L盐酸100ml溶解，避光保存。

需要说明的是，用甲醛消毒时也有不加高锰酸钾，而将甲醛直接放入空调器送入房间及用氨水中和的方法。

不管采用什么方法，只要经过验证是可行的，都可以使用。

【示例2】洁净室（区）臭氧消毒的验证

1．臭氧消毒方法

臭氧消毒一般分为系统消毒及局部消毒，如单个缓冲间、传递间等。

⑴通过空气净化系统（HVAC）对房间进行消毒。

根据洁净室（区）体积和HVAC系统的风管体积（或风量）、臭氧杀菌效果选用相应的臭氧发生器。

可将主机置于空调系统的总送风管或回风管道的合适位置，电源控制系统置于机房。

消毒时关闭相应的新风进口和回风排放阀门，使整个被消毒的洁净区空气通过净化系统风管形成循环，臭氧发生器即开始工作。

如每日做空气灭菌，一般可开机1～1.5h；

如每周以臭氧替代化学试剂熏蒸对表面、墙壁、地面及设备灭菌，一般可开机2～2.5h。

其优点是：

在被消毒的房间里不需要增加任何消毒设备，即可达到规标准的要求，保持良好的工作环境，也可直接安装在空气处理设备中，使臭氧发生器的安装与维护变的更加简洁和方便。

⑵臭氧发生器直接放在房间使用。

2．臭氧发生器消毒的计算

以选择合适的臭氧发生器为前提，设洁净室（区）体积为V1，HVAC系统风管容积为V2，V3为保持洁净区正压所补充的新风的臭氧消耗量。

则消毒空间体积为：

V=V1+V2+V3

式中V3的确定根据消毒实践，归纳出较为可靠的经验公式如下：

V=HVAC系统循环总风量（m3/h）×

25%（假定新风补充量为25%）×

10%（保持洁净区正压需补充的新风量）×

37.75%（计算应用臭氧半衰率的预算值）

即：

V≈系统循环总风量×

0.944%

3．臭氧发生器的选择

先按臭氧灭菌的效率和《消毒技术规》的标准决定臭氧的浓度（C）：

对空气中浮游菌，臭氧灭菌浓度为（2～4）×

10-6；

对物体表面的沉降菌，为（10～15）×

10-6（臭氧灭菌浓度参考卫生部1991年12月颁布的《消毒技术规》）。

臭氧的半自然半衰期（S）参比状态下为20min左右；

1h的衰退率为62.25%；

设计应用臭氧灭菌60min达到相对浓度后，继续保持一段时间（1～1.5h），即可达到对机器设备和建筑物表面沉降菌杀灭的目的。

例如，消毒空间体积（V）为600m3,要求杀灭设备和建筑物表面沉降菌。

按照上述要求空气中臭氧的浓度（C）应达到10×

10-6，折算为19.63mg/m3。

臭氧发生器在工作1h后臭氧自然衰退率（S）为62.25%，则选择臭氧发生器的臭氧发生量W（mg/h）：

CV19.63×

600

W===31200（mg/h

1—S1—0.6225

【示例3】工器具进入无菌室前的消毒验证

工器具进入无菌室前必须在设备气闸室（也叫缓冲间、空气锁）先进行消毒，而人员不得通过设备气闸室直接进入无菌室。

设备气闸室的两个门无论在什么时候都不能同时敞开，否则便回将无菌区暴露于外环境，以至危及无菌室的完整性。

工器具进入无菌室前的消毒举例如下。

一个操作者将它们搬入气闸室（但须避免横穿整个气闸室），进入后立即关上进门。

然后根据规定的SOP，操作者对其进行消毒，完毕从进门处退出。

待滞留达到规定时间后，另一操作者从无菌室另一侧进入气闸室并关上门，对第一个操作者曾触及的工器具部位及触及的地板的部位进行消毒，然后就可准备进入无菌室了。

当滞留达到规定时间后，就能搬入无菌区。

消毒验证立足于消毒的物件（如设备表面）的微生物量减少的结果。

一般步骤如下：

①消毒前先对工器具进行取样（取样点必须事先用书面规定）。

②按标准程序对工器具进行消毒，但消毒操作人员不应知道何处已被取样或将被取样。

③消毒结束后等待一定时间，再对此工器具或设备进行取样，取样数量应与书面规定的取样量相同，但取样区域应不相同。

必须强调由书面规定消毒剂和取样点。

所有的程序和实际操作都应该确保消毒恰当，包括消毒剂的制备、暴露时间、溶液温度、溶液寿命和使用方法等。

下表是某一个设备消毒前后取样的例子。

设备消毒前后的采样

样品号

RODAC盘（P）或棉签（S）

消毒前

消毒后

2

4

6

7

8

9

S

P

左后轮

左前