生物显微技术实验Word文档格式.docx
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(3)整体封藏法将完整细小的组织块进行处理,封藏为永存片,如叶表皮整体制片、团藻、水绵、黑根霉等装片。
(4)整体透明法用透明剂将较小的材料整体透明,经透明以后可以在显微镜下观察其内部结构。
(5)胚囊酶法分离技术对植物的胚珠进行酶解,将胚珠内部的完整胚囊分离出来,用于研究胚囊的发育、或者进一步分离出卵细胞。
(二)按是否能长期保存来分,可分为二类:
(1)临时制片法:
制片用于临时观察,不需要长期保存(如临时装片、徒手切片、冰冻切片等)。
(2)永存片制片法:
制片可以长期保存(如石蜡切片、半薄切片、超薄切片等)。
四、教学基本要求
1、要求重点掌握的技术:
石蜡制片技术(包括:
取材、固定、脱水、包埋、切片、展片、烤片、染色、透明与封藏);
2、要求掌握的一般技术:
(1)植物其它切片制片方法(徒手切片法);
(2)非切片制片技术(压片法、涂片法、整体透明法、酶解法等)
(3)摄影及照相机的使用方法;
实验一生物制片样品的选取与固定技术(2h)
一、实验目的要求
了解生物制片样品的选材与固定技术,为石蜡切片做准备。
二、实验原理
1、选材与切割:
根据不同制片目的和制片方法选取合适的材料;
材料要求新鲜,无病虫害;
先作徒手切片或剥离检查,决定适宜的材料立即固定处理;
材料大小要适当,如根的直径在5mm以内的,可切取5-10mm长的小段,直径在5mm以上者可纵分割成1/2或1/4,横切厚度约3-5mm;
叶的切割可切成2-5mm,若叶较宽可切10mm的长条,叶面切取的部位,以研究者的目的灵活选取。
切取材料必须使用新刀片,刀口和叶面垂直迅速切割下来;
花、果的切割:
花药和雌蕊切割,花芽和幼穗的切割,须剥去外部鳞片及叶鞘和其它部分,切去多余部分再放入固定液,有的花序则需去掉外方苞片,一般小的花不经切割可投入固定掖,大花果才进行分割处理。
2、杀生(杀死):
在制片过程中,将拟制片的材料(细胞或组织块)迅速杀死,使组织块尽量保持原生活时状态,这种处理通称杀生。
杀生时常用一种或多种化学药品处理。
一般以渗透力较强的药剂作杀生剂效果比较好。
3、固定:
在杀生处理的过程中,将器官、组织、细胞按原来的形态保存下来,并为后续制片保持固有形态,这样才达到固定的要求。
杀生与固定关系密切,通常二者兼有作用。
4、保存:
组织块经杀生固定后,能较长时间保存下来,经久保存下来的组织块,仍能制片,如酒精、醋酸,福尔马林液保存时间较长;
而铬酸类固定液,常须转换70%酒精液后保存,才可较长时间保存。
三、实验材料与试剂
材料:
南瓜茎或禾木植物的茎
试剂:
1、F.A.A固定液(福尔马林-冰醋酸-酒精)
(1)福尔马林(38%甲醛)5mL
(2)冰醋酸5mL(3)70%酒精90mL
2、F.P.A固定液(福尔马林-丙酸-酒精)制片效果有时较F.A.A好。
(1)福尔马林(38%甲醛)5mL
(2)丙酸5mL(3)70%酒精90mL
3、CanoysFluid(卡诺氏固定液)
(1)纯酒精(或95%酒精)15mL
(2)冰醋酸5mL
四、实验操作步骤
1、取样:
用锋利刀片将南瓜茎切成小段,用作横切的切成0.8cm长,用作纵切的切成1cm长,并切去相对两侧少许,最好选择髓腔较大的样品纵切为两半,髓腔较小的样品不用纵切;
2、固定:
用FAA固定24h,抽气,除去材料中的气体,并保存于固定液中;
3、软化:
先经70%、50%、30%酒精及降至蒸馏水(每次瓶装1/3试剂)分别处理2-4h后,置于15%氢氟酸中软化10-15d备用。
氢氟酸可将硅化物软化去除南瓜茎表面的硅化物颗粒,便于制片。
思
考
题
与
参
文
献
思考作业:
1、生物制片如何选择材料?
2、杀生和固定有何意义?
参考文献:
1、王灶安.植物显微技术.北京:
农业出版社,1992
2、李和平.植物显微技术.华中农业大学,2006电子版
3、李正理.植物组织制片学.北京:
北京大学出版社,1996
实验二植物显微化学制片(2h)
掌握植物徒手切片的制作技术与方法。
利用临时装片进行显微化学鉴定,掌握常用植物显微化学实验的原理与方法。
植物显微化学:
将材料以徒手切片方法制成薄片,应用化学反应或染色与化学反应相结合的方法,将组织或细胞内的某种化学成分(淀粉粒、蛋白质、脂肪、果胶质、纤维素及木质素等)在组织切片内予以显示。
用于研究和测定植物的器官、组织及细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布,简便迅速的方法,是野外调查和室内鉴定的极好方法。
土豆
碘-碘化钾溶液:
(1)碘化钾2g;
(2)碘1g;
(3)蒸馏水300mL
配法:
先将碘化钾加热溶于5mL蒸馏水中,然后加入碘,待其溶化后再将溶液稀释至300mL。
四、实验操作步骤
1、制作土豆临时装片:
徒手切片法制作
(1)将材料切成长约2~3厘米的小段,削平切面。
(2)左手的三个指头拿住材料,使之固定不动摇。
为防止刀伤,材料上端应超出手指2~3mm,不可高出过多,否则切片时材料容易动摇,也不容易切薄。
(3)右手大拇指和食指捏住刀片的右下角(刀片要非常锋利,双面刀片必须是新用的),刀口向内,并与材料切面平行,切片前先将材料和刀口上蘸些水,使之切时滑润。
(4)切的方法,以刀口自外侧左前方向内侧右后方拉切,这样可以边切边看清切片的进展情况,同时切起来也比较顺手。
切片时只用臂力而不要用腕力及握刀指关节的力量,左手保持不动,不要两手同时拉动,两手不要紧靠身体或压在桌子上,并且动作要敏捷,材料要一次切下,切忌中途停顿或推前拖后作“拉锯”式切割。
关键是要切得薄而平。
如此连续切片,切下数片后,用湿毛笔将切片轻轻移入培养皿的清水中备用。
(5)在切片过程中刀口和材料要不断蘸水,以保持刀口锋利和避免材料失水变形。
所切的材料和刀片一定要保持水平方向,不要切斜,如果切斜,即使很薄,但由于细胞切面偏斜,同样影响观察。
(6)切下足够多的切片后,挑选薄而平的切片做成临时装片供镜检。
挑选切片时,不一定要材料切得很完整,只要切得很薄就行,有时只要有一小部分就可以看清其结构了。
因此切下的切片不是每一片都适用,也不是只有全面切得薄的才能用,要根据需要进行选择,一次可多选几片置于载玻片上,制成临时装片,通过镜检再进一步选择理想的材料用以观察。
2、染色:
I2-KI溶液染色,取一滴配好的溶液滴在切片材料上染色30S,水洗;
3、观察:
盖上盖玻片置显微镜下观察,可见细胞内含许多被染成蓝色的卵圆形
或椭圆形颗粒,即为淀粉粒。
于高倍镜下观察,可见马铃薯淀粉粒依脐点和轮纹不同有单粒、复粒和半复粒三种类型。
(1)单粒淀粉(图A):
每粒淀粉有一个脐点,围绕脐点有许多同心环,即轮纹。
(2)复粒淀粉(图B-D):
每粒淀粉有二个或二个以上的脐点和各自的轮纹,而无共同的轮纹层。
(3)半复粒淀粉(图E):
每粒淀粉具有二个或二个以上的脐点和各自少数的轮纹,还有共同的轮纹层。
作业
1、碘液染色时间稍长(30s以上)出现黄色为何物质?
2、绘制马铃薯三种类型的淀粉粒图,并引线注明。
备
注
实验三生物样品的非切片制片法-木材解离制片
掌握生物样品的非切片制片法-木材解离制片原理与方法,并观察木质部各组成细胞的形态结构。
不经过切片而是以机械或药物将一部分细胞(或组织)或各个细胞分开的制片法称非切片制片,如用机械法分离叶表皮制片;
用药物解离根尖、茎尖、木材等。
木材
浓硝酸
1、解离将被检查的木质部切成火柴梗粗细,长约1-2cm的小段。
解离方法常有两种,任意选择。
(1)将切好的材料置于试管或烧杯中,加浓硝酸使材料浸没,再加入数小粒氯化钾,水浴(或酒精灯)上加热至有气泡发生并使材料变白为止(为了安全需在排气柜内进行)。
此法解离效果较好。
(2)将切好的材料放于培养皿中,加入过氧化氢一冰醋酸液(以过氧化氢1份+冰醋酸1份配制)密闭后,放置25-30℃温箱(台)中,解离1-2小时,待解离适当转入下一步。
该法解离效果欠佳。
2、水洗:
用尼龙纱网滤去酸液,再换水浸泡数次,尽量除去酸液。
3.保存:
用玻璃棒捣散组织,转入离心管中进行离心处理,或静置沉淀后,吸去上清液,另加入50%酒精保存备用。
4.染色:
取少量木质部解离组织,置1%番红液染5min左右。
5.水洗:
水洗数次去浮色。
(至少3次)
6.粘片:
用玻棒蘸取含有木质部细胞的水液,均匀涂布载玻片上,转置36℃温箱中烘干。
7.封片:
二甲苯过一遍,加拿大树胶封片(可不做)。
8、观察:
解离细胞呈深红色。
作
业
(茎)缘孔纹导管阶纹导管(茎)网纹导管
木质部发达的螺纹导管木质部发达的缘孔纹、螺纹导管
思考题与作业:
绘图并描述导管细胞的形态。
单孔导管
参考文献
实验四石蜡法制片——样品的脱水、透明与浸蜡(8h)
掌握石蜡制片中脱水、透明和包埋的主要原理与方法。
了解各种透明剂的特点,了解实验中出现问题的原因。
1、脱水:
用的脱水剂去除组织内的水分,并使其组织细胞变硬;
从而使溶解的石蜡顺利进入细胞内,以便进行石蜡切片。
常用脱水剂有:
乙醇(酒精)、二氧六环、正丁醇、叔丁醇、丙酮等药剂。
2、透明:
是制片过程中的基础工作,材料经各级酒精脱水以后,要经过常用的有机溶剂进行透明,这样便于包埋剂(石蜡)及封藏剂(加拿大树胶)进入和溶合。
只有当组织材料全为透明剂所占,并在显微镜下观察呈透明状态时,这种材料才符合制片要求,故透明是制片的重要环节。
常用的透明剂有氯仿,二甲苯等。
3、浸蜡:
在装有材料的纯氯仿瓶中,分次逐步加入纯石蜡蜡片,以石蜡透入细胞组织内的全过程,称为浸蜡。
浸蜡完全的材料,组织块显得十分透明。
氢氟酸处理的南瓜茎
1、苯胺番红酸性染料溶液
(1)苯胺蓝1g
(2)85%或95%酒精100mL
2、无水及不同浓度的酒精溶液
3、纯氯仿
4、石蜡:
软材料用54-56℃熔点的石蜡,若切5μm以下的厚度或炎热夏季切片时,宜用58-60℃的石蜡。
石蜡商标上须注明为“生物组织切片用蜡”字样,选用时还必须检查石蜡细致度、无气泡、无灰尘、无透明点痕、切片时不断裂、不碎等优点。
工业用蜡不能使用。
新石蜡和用后已切碎的石蜡,都必须经过先熔化,然后用3-4层桑皮纸,折叠成漏斗形,进行过滤除去渣滓。
50%石蜡:
一半石蜡和一半二甲苯配制而成;
70%石蜡:
70%石蜡与30%二甲苯配成;
1、整染:
将氢氟酸处理(13d)后的南瓜茎取出,用流水冲洗20h,蒸馏水浸泡洗涤3次,每次2h,然后经苯胺番红整染48h。
2、多级酒精脱水:
经30%、50%、70%、85%、95%及无水酒精处理各2h。
3、多级氯仿透明:
经1/5、2/5、3/5、4/5及纯氯仿通明各2h。
4、浸蜡:
经50%、70%及纯蜡A、B置恒温箱中浸蜡各2h。
包埋时作横切的样品竖放,作纵切的样品卧放。
附步骤及过程表
思考题与作业
脱水、透明对材料的浸蜡与包埋有何影响?
实验四脱水、透明与浸蜡步骤及过程表
天数
时间
步骤
第一天
实验课内
取流水冲尽酸液(自来水冲20h),换蒸馏水冲6h,再用苯胺番红整染48h。
第三天
7:
3030%
9:
4050%
11:
4070%
15:
4085%
19:
4095%
酒精完全浸没材料超过1~2cm
第四天
30
40
无水酒精
无水酒精最好3次,最后1次划格子,共划5格
1/5氯仿
2/5氯仿换软木塞,每次吸出一格,加入一格纯氯仿
3/5氯仿
第五天
304/5氯仿
40纯氯仿
40纯氯仿15:
40碎蜡
同上
全部吸出后,再加纯氯仿
再换1次纯氯仿
第一次加少量碎蜡
第二次加溶液体积的20%36℃恒温
第六天
50%蜡40~42℃
70%蜡48~50℃
纯蜡A再换橡胶塞
纯蜡B56~58℃
纯蜡C63℃石蜡溶化为止
第七天
课内完成
包埋
附
录
一、几种常用的脱水剂及脱水方法
1、乙醇(酒精)(ethylalcohol)乙醇是常用的脱水剂,但因易使组织收缩及发硬,故不是理想的脱水剂。
在配制脱水剂时,用95%酒精配制为15%、30%、50%、70%、85%等各种浓度的酒精。
由低浓度到高浓度按级过渡脱水过程。
一般材料从30%酒精开始,细胞学常以15%酒精开始,有时用与固定液同浓度的酒精开始脱水。
低浓度中不能停留时间太久,否则材料易吸水膨胀,高浓度(在95%无水酒精内)中也不能停留时间过长,否则材料易脆化收缩。
为脱水彻底,在无水酒精中应两次,如果材料转入二甲苯中,有乳白悬浮液出现时,说明脱水不彻底,应退回无水酒精中继续脱水,在脱水进行中,应避免在无水酒精内过夜处理。
2、二氧六环(dioxan)(CH2)4O2又名二氧杂环己烷、氧化二乙烯。
为无色液体,易挥发燃烧,有毒性化合物,不适宜学生实验用,因其毒气是无臭的,吸入后,毒性有积累作用,故开瓶后须十分小心,勿使毒气扩散出。
二氧六环与水及酒精、油类以任何比例混合,其优点:
①兼有脱水和透明作用,不会使组织硬化和收缩,在脱水时,以逐级二氧六环脱水至纯二氧六环后进入石蜡,但其比重大于石蜡,故在进入石蜡前,通过一次氯仿处理驱赶尽二氧六环后再转入浸蜡为好。
②固定液中含有苦味酸的,不必多冲洗即可转入二氧六环中。
③大的材料在浸入二氧六环前,先浸入苯胺油,其结果更好。
④重铬酸钾在二氧六环中不溶解,可在材料中成黄色的染色剂。
⑤浸入冷的二氧六环中,放于冰冻切片机的冻盘上,可冰冻切片。
3、正丁醇(normalbutylalcohol)此剂可与水、酒精、二甲苯等剂混合,也可单独或与酒精配级混合使用,是常用的脱水剂。
为黄色液体,易挥发,吸入后有人会产生头痛,有人则无反应。
其优点:
不会使组织收缩或变硬,能溶解石蜡,可不经透明剂直接浸蜡,脱水时,用正丁醇和酒精配成一定比例,逐级处理至纯正丁醇后,再转移至正丁醇与石蜡等量
混合液中,最后移入包埋蜡杯中,完成包埋工作。
4、叔丁醇(Tertiarybutylalcohol)(简称TBA)是较正丁醇更好的一种脱水剂,可单独用或与酒精混合用;
为无毒性、不会使组织收缩和变脆,还可不经过透明剂,其比重轻,易从石蜡中除去,故可简化脱水、透明、浸蜡等步骤;
因其价格较贵,不宜一般实验用。
熔点为25℃。
具体脱水级别与配法如下(单位:
mL):
浓度级别1234567891011
95%酒精5111830405050402500
蒸馏水958983705030155000
TBA(叔丁醇)00001020355575100100
相当于酒精(%)511183050708595100100100
1)材料经固定水冲洗后,先由5%浓度酒精开始脱水至50%酒精(每级经1h)。
2)到第六级时转入欲配制的TBA级别(此时处理时间为一夜)。
3)7级至9级又为1h。
4)10-11级为12-24h;
从11级即可加碎蜡进行透蜡处理。
5、丙酮(Acetone)可代替酒精作脱水剂,脱水能力强于酒精,但对组织收缩力较大,能使蛋白质沉淀,组织硬化。
与水、醚、酒精、氯仿、苯等能任意混合,但不能溶解树脂、石蜡,所以仍需经过透明剂处理后才能包埋。
以上脱水剂各有其优缺点,但使用最多的仍为酒精。
6、甘油(Glycerin)是藻类、菌类、高等植物的原丝体、原叶体等良好的脱水剂。
使用时较少收缩现象,甘油脱水前,必须冲洗干净固定液,以免影响包埋、染色等处理。
脱水级差从5%开始,到纯甘油。
如发现水仍未脱尽,临时以正丁醇补充脱水一次。
二、几种常用的透明剂及透明方法
透明剂都是石蜡的溶剂,不能与水相混。
现介绍以下透明剂。
1、二甲苯(xylol)为较其他透明剂价格便宜,应用普遍的一种无色透明液体,能与酒精混合,也可溶解石蜡,并能与树胶混合成封藏剂,但不溶于水,
透明力强、速度快;
其缺点是:
使组织收缩变脆,故在二甲苯中不宜停留时间过长,同时必须在材料完全脱水后方可使用二甲苯,若有极少量水分在组织内存在,就会出现乳雾状现象,通常在无水酒精与二甲苯之间,增添1/2无水酒精和1/2二甲苯的混合液,以便脱水彻底又可使材料减少收缩。
装二甲苯的器具盖,要随手关闭,以免挥发污染室间空气。
2、氯仿(chloroform)为常用的透明剂,能与酒精混合,溶解石蜡,在石蜡制片中,浸蜡前的透明多采用氯仿,本编者习惯使用此剂。
其优点是:
①组织在氯仿中浸久虽有收缩,但不强烈;
②易挥发,如浸蜡时渗入组织中的氯仿经蜡温易驱赶出去。
不足之处是:
渗透力稍弱(如比二甲苯、苯透明慢),可延长透明时间便于工作安排,另外,氯仿能退色,一般染色后的切片,不以氯仿处理。
一般用三级氯仿透明,若材料柔嫩可以增加到五级透明处理。
3、冬青油(wintergreenoil)即水杨酸甲酯(Methylsalicylate),又称冬绿油。
可作整体制片的透明剂,效果较好,对维管系统的制作透明也很理想,但其渗透力很慢,且具毒性,用时要小心。
4、丁香油(cloveoil)为切片染色后封固前最好的透明剂;
有的染料,如固绿、桔红G可以丁香油配成饱和溶液,有作染色、分色、透明三步合并应用效果。
另能溶于酒精及氯仿,可用95%酒精混合使用,而二甲苯必须用纯酒精混合;
丁香油的透明力比二甲苯效果好。
其缺点是易使组织变脆,且经丁香油透明的切片,需经二甲苯复处理,染色的部分才鲜明,封片后干燥时间较二甲苯长。
5、香柏油(cedaroil)为无色或绿色的芳香挥发性油,极毒,用时必须小心。
纯香柏油常用于油镜使用上,使用此油作透明剂,不易使材料收缩变硬,作用慢,一般透明时间在10h以上,且不易为石蜡代替。
如用石蜡制片,仍须通过二甲苯一次,以除尽香柏油才利于石蜡透入组织内。
6、苯(benzene)苯的透明作用与二甲苯相似,用法相同,且收缩较少,但易挥发、爆炸,吸入苯后会引起中毒,尽量少用。
7、甲苯(toluene)甲苯的性能与二甲苯相同,可作二甲苯的代用品;
其透明力慢,
组织浸置甲苯中10h以上也不变脆。
实验五细胞组织分离制片法(4h)
掌握组织分离制片原理与方法,并观察表皮细胞的形状及气孔的构造。
学习数码显微照相技术。
以机械或药物将一部分细胞(或组织)或各个细胞分开的制片法,如用机械法分离叶表皮制片。
器材:
生物显微镜、滴瓶、镊子、大方滤纸、培养皿、毛笔、染色缸、载玻片、剪刀、
蚕豆叶
1%番红水溶液;
1%龙胆紫;
无水乙醇;
盐酸;
二甲苯;
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