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1.1丙型肝炎流行与危害3
1.2丙型肝炎治疗药物3
1.2.1标准治疗药物4
1.2.2开发中的药物5
1.2.2.1干扰素类5
1.2.2.2利巴韦林替代物7
1.2.2.3NS3/NS4A丝氨酸蛋白酶抑制剂8
1.2.2.4NS5B聚合酶抑制剂10
1.2.2.5环孢素结合蛋白抑制剂11
1.2.2.6免疫调节剂12
1.2.2.7核酸靶向治疗12
1.2.2.8中药及天然提取物治疗13
1.3东紫苏及香薷属植物研究概况14
1.3.1香薷属化学成分研究概况14
1.3.2香薷属植物生物活性研究进展15
1.3.2.1抗病毒活性15
1.3.2.2抗炎活性15
1.3.3.3抑菌活性15
1.4研究的目的、意义和技术路线16
1.4.1研究目的与意义16
1.4.2技术路线18
第二章东紫苏的粗提19
2.1引言19
2.2实验部分20
2.2.1实验仪器与材料20
2.2.2植物来源21
2.2.3实验原理21
2.2.3.1溶剂提取法的原理21
2.2.3.2萃取的原理22
2.2.3.3色谱方法用于分离纯化的基本原理23
2.2.3.4植物有效成分分离纯化中常用的制备色谱24
2.2.3.5显色原理25
2.2.4实验过程及结果25
2.2.4.1提取25
2.2.4.2萃取26
2.2.4.3色谱粗分离26
第三章东紫苏粗提物抗HCV活性研究28
3.1引言28
3.2材料与仪器28
3.2.1主要仪器28
3.2.2主要试剂29
3.2.3主要溶液配制29
3.3实验方法30
3.3.1细胞培养30
3.3.2病毒培养30
3.3.3Huh7.5.1细胞生长曲线30
3.3.4丙型肝炎病毒(HCV)核酸荧光定量PCR检测31
3.3.4最适感染复数33
3.4东紫苏粗体物抗HCV药物筛选方法应用34
3.4.1引言34
3.4.2方法34
3.4.2.1样品及处理34
3.4.2.2细胞和病毒34
3.4.2.3MTT法检测药物细胞毒性35
3.4.2.4样品抗病毒效果评价35
3.5东紫苏抗HCV实验结果36
3.5.1阳性对照利巴韦林对细胞的毒性的评价36
3.5.2阳性对照利巴韦林和干扰素体外抗HCV有效性的评价37
3.6三种天然化合物抗HCV活性38
3.6.1东紫苏粗提物石油醚段抗HCV活性38
3.6.2东紫苏粗提物正丁醇段抗HCV活性39
3.6.3东紫苏粗提物乙酸乙酯段抗HCV活性39
第四章结论与体会41
致谢42
参考文献43
第一章绪论
1.1丙型肝炎流行与危害
丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)是导致慢性肝炎的主要病原体,流行广泛,危害严重。
据估计,全世界约1.7亿人(总人口的3%)感染HCV病毒,非洲HCV感染率较高,亚洲次之,欧洲、美洲的HCV感染率较低。
不同性别、年龄、种族的人均可被丙型肝炎病毒感染,成人的感染率高于儿童。
HCV主要经由血液途径传播,包括输血传播和静脉吸毒,性接触与无保护分娩也可能导致HCV传播。
丙型肝炎病毒一经感染,只有20%的感染者能依靠自然免疫力清除病毒,大多数感染者会发展成为慢性感染。
慢性丙型肝炎的特点是肝脏炎性病变,肝内脂质堆积(脂肪肝),并伴随不同程度的纤维化,较大比例丙型肝炎患者可最终进展为肝硬化、肝癌。
丙型肝炎不易发现,多数丙型肝炎病人无明显临床症状,大部分病人出现临床症状时已经发展为肝硬化甚至肝癌,健康和生命受到严重威胁。
对于丙型肝炎的治疗,目前标准的治疗措施为聚乙二醇化缓释干扰素-α与利巴韦林联合疗法,但是这种治疗方法毒副作用大、疗效有限,特别是对全球最流行的1b型HCV感染者,治疗反应性很差,亟待研发研制更有效的新型抗HCV药物。
1.2丙型肝炎治疗药物
治疗丙型肝炎的主要目标是从血液清除病毒,从而检测不到病毒RNA。
成功的治疗特点是产生持续病毒学应答(sustainedvirologicalresponse,SVR),定义为终止治疗后6个月,敏感检测方法在血液中检测不到HCVRNA(检测范围≤50IU/ml)。
近期大量的研究显示,产生持续病毒学应答后4-6年内99%的病人都没有再复发。
目前,临床上HCV的标准治疗药物是干扰素和利巴韦林。
利巴韦林能使患者产生持续病毒学应答,但同时也存在着副反应,并对基因型1型的患者只能产生15%的持续反应,与利巴韦林使用能够比单一疗法持续性反应提高30%-40%。
近年来,对丙型肝炎药物的改进和新药的开发取得不了不小的进步。
1.2.1标准治疗药物
1)干扰素
干扰素是一种天然的细胞因子,有免疫调节、抑制增生和抗病毒的作用。
干扰素作为潜在的治疗慢性丙型肝炎的药物是在1986年被实证的。
在那时,引起“非A,非B”型肝炎的病因还尚未确定,也没有评价药物抗此病毒活性的方法。
干扰素的使用,是因为它已被证明能够抑制一些人肝炎病毒的复制,如甲型肝炎和乙型肝炎病毒。
首次对非A、非B型肝炎患者使用干扰素治疗后,观察到8个患者丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)显着下降,并有3例患者在治疗结束后的活检中发现肝组织学有明显改善[1]。
10年后,10例患者中5例脱离感染[2]。
聚乙二醇干扰素(pegylatedinterferons,PEGIFNs)是由不同大小且无活性的水溶性聚乙二醇聚合体与干扰素分子共价结合而成,提高了蛋白质抵抗水解作用的能力与蛋白的水溶性,改善了药物代谢动力学,使半减期延长至40-80h,从而达到每周一次给药,提高了生物利用率,并进一步降低了毒性。
现有两种聚乙二醇干扰素-α通过了欧洲药品局的FDA(FoodandDrugAdministration,FDA)认证,为聚乙二醇干扰素α2a(pegylatedIFNα-1b)和聚乙二醇-α2b(pegylatedIFN-α2b)。
聚乙二醇干扰素-α2a用药固定剂量为180μg/week,聚乙二醇-α2b用药根据体质量以1.5μg/kg/week。
报告显示,单独用药48周后,这两种聚乙二醇化干扰素SVR率都比相应标准的干扰素-α高出2倍[3]。
2)利巴韦林
利巴韦林为鸟苷类似物,有广谱抗病毒活性,在体内外对病毒DNA和RNA都有一定的抑制作用。
利巴韦林在体内转化为利巴韦林5'
单磷酸盐(Ribavirin5'
monophosphate,RMP)、利巴韦林5'
二磷酸(Ribavirin5'
diphosphate)和利巴韦林5'
三磷酸(Ribavirin5'
triphosphate,RTP),利巴韦林5'
三磷酸是哺乳动物是细胞内主要的代谢物[4]。
RTP可被病毒的聚合酶当作底物,从而抑制RNA延长。
但是,RTP对HCVRdRp(RNAdependentRNApolymerase)只是一个弱效抑制剂[4,5]。
Fig1.4Anti-viralmechanismofRibavirin[4]
1.2.2开发中的药物
1.2.2.1干扰素类
1)白蛋白干扰素-α
白蛋白干扰素-α2b(Albumin-IFN-α2b,Alb–IFN–α2b)是一种新型的87.5kDa的重组蛋白,由干扰素-α2b的分子附着在人白蛋白基团上形成。
Alb–IFN–α2b半衰期高达159小时,允许间隔2至4周用药[12]。
对猴子进行单剂皮下注射进行药物代谢动力学研究表明,Alb–IFN–α2b较干扰素-α代谢速度慢约140倍,半衰期长18倍[13]。
已经有报道,Alb–IFN–α2b在以前未经治疗的、对聚乙二醇干扰素-α和利巴韦林联合治疗无反应的患者身上引起了剂量依赖性抗病毒反应[14]。
在第二阶段的临床实验中显示,未经治疗的基因型1型患者的SVR率与接受标准治疗聚乙二醇干扰素-α2a、聚乙二醇α2a与利巴韦林联合、白蛋白-干扰素α2b的患者之间无明显不同,其剂量分别为每两周900μg、每两周1200μg和每四周1200μg[15]。
对Alb–IFN–α2b有应答反应的基因型1型患者,以2-4周结合利巴韦林治疗结束后与受基因型2和3感染的患者效果相似[16]。
白蛋白干扰素-α2b每4周高剂量给药的效果,目前正在研究中,该产品即将进入第三阶段临床评价。
2)“Gene-shuffled”IFN-α
干扰素-α的新型变种已经通过DNA洗牌技术产生的。
在这种技术中,将天然干扰素-α的基因切成片段,然后通过重组重新组合,是一个模拟进化的过程。
通过基因洗牌的干扰素变种有可能增加抗病毒和抗增殖活性[17]。
目前,已经从建立的一个克隆文库(Maxygen,RedwoodCity,California,andRoche)中,筛选出的两个克隆较人干扰素-α在体个有更好的活性,并且其中之一已经聚乙二醇化,并会很快进入临床评估。
3)ConsensusIFN-α
名为“IFNalphacon-1”(Infergen,Amgen,ThousandOaks,California)的干扰素,为合成重组的“consensus”IFN-α分子,是通过将各种型的IFNs分子中最常见的氨基酸序列进行扫描后,重新分配而形成的重组干扰素[18]。
这种重组型干扰素抗病毒活性高于标准干扰素10-100倍[19,20]。
对IFN-α单一治疗后复发的病人使用ConsensusIFN-α比IFN-α-ribavirin联合标准治疗SVR率高[21]。
对患者IFN-α-ribavirin联合治疗失败后,给于ConsensusIFN-α治疗,SVR率约为30%[22]。
对未进行过治疗的受HCV基因型1型感染的患者分别给consensusIFN-α-ribavirin和IFN-α-ribavirin治疗,出现了相似的SVR率37%和41%[23]。
不过,也没有明确的证据显示在同等剂量下ConsensusIFN-α优于其它干扰素。
ConsensusIFN-α的发展将依赖于聚乙二醇化以及其它药理学上的修改。
4)其它IFN-α分子
Multiferon(Viragen,Plantation,Florida)是一种源自人类白细胞的高纯度,多亚型天然人干扰素-α。
在一些国家它已被批准用于治疗丙型肝炎。
Medusa(FlamelTehnologies,Lyon,France)是一种自我组装的多聚氨基酸纳米粒子体系,是新型的可作为长效天然蛋白药物的载体。
MedusaIFN-α2a和MedusaIFN-β正在进行早期临床开发。
1.2.2.2利巴韦林替代物
1)Viramidine
Viramidine一种肝脏靶向药物,是利巴韦林的非活性前体,在肝细胞腺苷脱氨酶的作用下脱去氨基转化为利巴韦林,使利巴韦林在肝中积累而不是在红细胞中,以此降低对红细胞的毒性作用,其耐受性也明显提高。
该药物免疫调节活性的研究表明其对Th1型细胞因子的产物、T细胞的增殖的影响与利巴韦林类似[24]。
在II期临床观察中,PEGIFNα-2a分别与Viramidine、ribavirin联合治疗慢性丙型肝炎患者,结果显示治疗组间无显著差异,但是Viramidine组贫血发生率比ribavirin组明显降低(4%对27%,P<0.001)。
每天400mg两次给药的患者中没有出现贫血症状,每天800mg两次给药的患者有2%出现贫血症状。
III期正在对Viramidine(1200mg/d)与PEGIFN-α-2b联合治疗的有效性进行评价。
2)Merimepodib(VX-497)
Merimepodib(VX-497)是一种复杂的口服IMPDH抑制剂,分子量为452.5kDa。
是用于治疗HCV感染的新型药物,其可以抑制IMPDH的所有亚型,并且和结构不相同的其它药物有相同的催化活性。
Merimepodib对其它DNA和RNA病毒也有明显的抗病毒活性[25]。
IFN-α分别与Merimepodib、Ribavirin联合治疗证明,Merimepodib有较温和的添加活性,IFN-α-Merimepodib比IFN-α-ribavirin有更好的抗病毒效果。
在体外与ribavirin和IFN-α联用可以协同抑制复制子体系中HCVRNA的合成,有研究显示,其还可以影响淋巴细胞的转移和增殖,暗示其还可消除肝脏炎症。
图1.5Viramidine化学结构
Figure1.5chemicalstructureofViramidine
图1.6Merimepodib化学结构
Figure1.6chemicalstructureofMerimepodib
1.2.2.3NS3/NS4A丝氨酸蛋白酶抑制剂
1)BILN2061
大环肽类药物BILN2061是非共价抑制剂,对NS3/NS4A有抑制作用,也是第一个进入临床观察的HCV蛋白酶抑制剂。
它被认为与NS3/NS4A的活性部位结合,导致催化三联体的失真以及氢键的断裂[26]。
这种化合物表现出可逆的非共价竞争抑制基因型1a和1b的NS3的蛋白酶,抑制常数分别为0.30和0.66nM,并显示出对NS3的高特异性,而不是对人类的弹性蛋白酶(丝氨酸)和组织蛋白酶B(半胱氨酸蛋白酶)起作用[27]。
BILN2061能使血浆中丙型肝炎病毒载量降低至3log10,但在临床试验中药效短暂,所以建议联合其它药物以达到有效治疗[28]。
BILN2061对基因型2和3的NS3蛋白酶的亲和力低于基因型1十倍左右[29]。
这可能是BILN2061对感染基因型2和3的患者抗病毒药物较弱并不稳定的原因[30]。
同时,体外试验证实NS3基因多个位点突变(Arg155、Ala156、Asp168)可导致HCV对BILN2061及其类似物产生高度耐药性,并且该药对实验动物超过4周的高剂量给药,出现心脏毒性致使BILN2061临床试验提前终止。
图1.7BILN2061化学结构
Fig.1.7chemicalstructureofBILN2061
图1.7VX-950化学结构
Fig.1.8chemicalstructureofVX-950
2)VX-950
VX-950是针对NS3结构设计的可逆共价结合的肽类抑制剂,抑制剂量为7nM的。
体外使用复制子的研究显示,BILN2061耐受突变株和VX-950的耐受突变株依然分别对VX-950、BILN2061敏感[31]。
相比BILN2061,VX–950对HCV基因型2仍然有很好的效果[32]。
VX-950与IFN-α联合治疗抑制病毒RNA水平达到4log10,并无任何细胞毒性[33]。
临床1b阶段的最后结果显示,正常个体与HCV感染者对VX-950都有很好的耐受性,并此化合物的抗病毒效果持久。
在有限研究中证明,VX-950治疗后所有个体的病毒载量都至少下降了2log10[34]。
2005年末,美国食品和药物管理局(FDA)批准VX–950获得快速通道以更好的治疗HCV感染者。
目前VX-950正在进行II期临床研究。
3)SCH503034
SCH503034是一种新的酮酰胺抑制剂,为最近发展的药效较好的口服抗病毒药物[35]。
在临床上表面出温和、高抗病毒活性以及良好的耐受性,但其也可诱导NS3蛋白3个位点(T54A、V170A、A156S或A156T)发生耐药性突变[36]。
SCH503034被建议的第一个适应症为丙型肝炎1型病毒感染患者标准治疗不应答的HCV患者。
SCH503034目前已经完成了Ⅱ期临床研究。
1.2.2.4NS5B聚合酶抑制剂
1)核苷类抑制剂NM283
NM283(也叫Valopicitabine)是核苷类似物2'
-C-甲基胞苷的口服前体,第一个被证实在人体内有抗病毒活性的聚合酶抑制剂,也是目前唯一临床上有效的核苷类抗病毒药物。
有研究报道,2'
-C-甲基嘌呤苷也有类似作用,因此推断核糖甲基化将核苷底物转化成了HCVRNA复制的抑制剂[37]。
NM283以50~800mg/d的剂量递增试验显示其疗效有剂量依赖性,800mg/d给药2周后可以使患者血液病毒载量下降至10%以下。
此药抗病毒活性较NS3-4A蛋白酶抑制剂低,但是安全性更高,研究显示,NM283临床试验更侧重于长期以及联合治疗,并且其对各种基因型都有效。
在Ⅱ期临床试验中。
NM283与PEG-α2a联合治疗,82%-92%的患者都能产生SVR,但是NS5B基因的变异能使病毒迅速获得识别甲基化和正常底物的能力从而产生耐药性。
NM283目前进入了III期临床试验。
2)核苷类抑制剂R1626
R1626是R1479的前体药物,在肠黏膜上转化为R1479[38]。
体外实验证实,R1626能与NS5B中高度保守的核苷酸位点结合,对所有基因型都有很好的抗病毒效果[39]。
II期临床治疗中,以1500mg或3000mg每天两次给药,显示出良好的抗病毒效果,但是中性粒细胞减少比例高达45%-78%,停药后复发率较高。
该药于2008年底停止研发[40,41]。
3)非核苷类抑制剂
非核苷类抑制剂主要通过特异性结合NS5B蛋白特定靶点,别构抑制RdRp分子转变为RNA复制必须的活性构象,从而阻断病毒的复制。
HCV-796是动物试验中表现出这较强抗病毒活性的药物[42]。
Ia和Ib临床试验对HCV-796单剂药物口服在健康受试者体内的安全性、耐受性、药物动力学等情况进行了验证。
目前此药正在进行临床评价。
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