赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案Word格式文档下载.docx
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3.1.2对照品溶液的制备
精密称取芍药苷对照品10.63mg,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品贮备液(每lml含芍药苷对照品425.2μg)。
3.1.3标准曲线的制备
分别精密量取对照品贮备液溶液(425.2μg/ml)0.5ml、l.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置10ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。
精密量取上述不同浓度对照品溶液各10μl注入液相色谱仪,按前述色谱条件分别测定其峰面积。
以对照品浓度X为横坐标,峰面积积分值Y为纵坐标,绘制标准曲线。
3.1.4供试品溶液的制备及测定
取提取液,稀释至一定体积,滤过,即得供试品溶液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,由外标一点法计算即得芍药苷含量。
3.2提取溶媒的筛选:
赤芍中所含苷类成分极性较大,在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。
本实验以芍药苷的含量为评价指标,考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率,筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。
见表1:
表1不同提取溶媒芍药苷含量
提取溶媒
水
50%乙醇
70%乙醇
溶媒用量(倍)
6
提取次数(次)
2
提取时间(h)
1.5
芍药苷含量(%)
3.3正交试验设计优化提取工艺
3.3.1因素水平设置
溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。
根据实际情况,设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素,因素水平设置见表2。
表2因素-水平表
因素-水平
A提取溶媒
(倍)
B提取时间
(h)
C提取次数
(次)
1
4
3
8
3.3.2实验安排及结果
考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、提取次数及相应水平,选取正交表L9(34)作正交试验,所选因素一水平见表2。
称取川赤芍药材约50g,按L9(34)正交试验表按排试验,以芍药苷含量(芍药苷含量=提取液中芍药苷质量/称取的药材量*100%)为评价指标。
试验方案见表3
表33L9(34)正交试验表
表头ABCD芍药苷含量
(%)
列号1234
11111
21222
31333
42123
52231
62312
73132
83213
93321
SS
3.3.3验证试验
以优化工艺条件重复试验3次,验证试验结果见表4
表4验证试验结果
试验试验号投料量固形物固形物RSD芍药苷芍药苷RSD
方案(kg)得率平均得率含量平均含量
(%)(%)(%)(%)(%)(%)
4赤芍总苷(TPG)的纯化工艺的优化
4.1上样液预处理
赤芍醇提液减压浓缩至无醇味,加水适量分散溶解、过滤定容,制成每毫升含0.2g生药(0.2g·
ml-1)的溶液,备用。
4.2大孔吸附树脂型号筛选
取AB-8型和D-101型大孔吸附树脂各20ml,装于树脂柱中(径高比为1:
8),取样液40ml上样。
先用3BV蒸馏水,再用5BV20%乙醇洗脱,合并乙醇洗脱液,测定,结果见表5。
从芍药苷吸附解析率和残液中芍药苷含量综合考虑,选择树脂种类。
表5树脂动态吸附实验结果
树脂型号
上样液含量
(mg)
吸附-解吸率
(%)
残液中含量
D101
207.31
AB-8
4.3上样浓度考察
取AB-8型大孔吸附树脂3份,每份20ml,装柱(径高比为1:
8),分别取含生药浓度为0.1g·
ml-1、0.2g·
ml-1、0.3g·
ml-1样品液上样,吸附流速为1.0ml·
min-1。
然后用3BV水洗脱,再以5BV20%乙醇洗脱,按4.3色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量,结果见表6。
表6 上样浓度考察结果
上样浓度(g·
ml-1)
0.1
0.2
0.3
芍药苷洗脱量(mg)
洗脱率(%)
4.4泄漏曲线考察
取AB-8型大孔吸附树脂20ml,装于树脂柱中(径高比1:
8),取样品液60ml上样,吸附流速为1.0ml·
收集流出液,每5ml为一流分。
按如下色谱条件测定,绘制泄漏曲线,确定最大上样量。
色谱条件:
DiamonsilC18色谱柱(250mm×
4.6mm,5μm);
乙腈为流动相A,水为流动相B,按表7进行梯度洗脱;
流速1.0ml·
min-1;
柱温25℃;
检测波长230nm。
表7流动相梯度洗脱时间表
时间/min
流动相A/%
流动相B/%
0~
14
86
20~
95
5
25~
4.5吸附流速的考察
8),取样液60ml上样,吸附流速分别为1.0ml·
min-1、2.0ml·
min-1、3.0ml·
进行动态吸附后,先用3BV水洗脱,再用5BV20%乙醇洗脱,按4.3色谱条件进行测定,结果见表8
表8吸附流速考察结果
吸附流速(ml·
min-1)
4.6树脂径高比考察
取直径依次为1.4cm、1.5cm、1.6cm的树脂柱3根,分别加入AB-8型大孔吸附树脂各20ml,装柱(径高比为1:
6、1:
8、1:
10),取样液60ml上样,吸附流速为1.0ml·
然后用3BV水洗脱,再以5BV20%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,按4.3色谱条件进行测定,结果见表9。
表9树脂径高比考察结果
树脂径高比
1:
10
4.7水洗除杂体积考察
取AB-8型大孔吸附树脂四份,每份20ml,装柱(径高比1:
8),取样品液60ml上样,吸附流速分别为1.0ml·
min-1,进行动态吸附后,分别用1BV、2BV、3BV和4BV水洗,测定水洗脱液中芍药苷的含量,计算损失率,结果见表10。
表10 水洗除杂体积考察结果
·
水洗脱体积(BV)
水洗液中芍药苷累积含量(mg)
芍药苷累积损失率(%)
4.8洗脱溶剂考察
取AB-8型大孔吸附树脂4份,每份20ml,装于树脂柱中(径高比为1∶8),60ml样品液上样,吸附流速分别为1.0ml·
然后先以3BV水洗脱,再分别用20%、40%、60%和80%乙醇洗脱,按4.3色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量,结果见表11。
表11 洗脱溶剂考察结果
洗脱剂乙醇(%)
20
40
60
80
4.9洗脱曲线
取AB-8型大孔吸附树脂20ml,装于树脂柱中(径高比为1:
8),60ml样品液上样,吸附流速分别为1.0ml·
然后先以3BV水洗脱,再用20%乙醇洗脱,每10ml收集一份,洗脱液减压至干,以10ml甲醇复溶,按4.3色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量,绘制洗脱曲线,确定洗脱剂用量。
5赤芍中赤芍苷提取物的质量控制
5.1性状:
棕褐色粉末,气微香,味微苦、酸涩。
5.2鉴别:
取本品粉末0.2g,加乙醇10ml,振摇5分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇2ml使溶解,作为供试品溶液。
另取芍药苷对照品,加乙醇制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液。
照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述两种溶液各4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:
5:
10:
0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝紫色斑点。
5.3含量测定:
照高效液相色谱法(通则0512)测定。
5.3.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(40:
65)为流动相;
检测波长为230nm。
理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
5.3.2对照品溶液的制备
取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。
5.3.3供试品溶液的制备
取本品粉末约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,浸泡4小时,超声处理20分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
5.3.4测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
将提取物中芍药苷含量换算成药材中芍药苷含量,对比药典,检查提取纯化工艺是否合适。
2015版《中国药典》中规定赤芍药材中含芍药苷(C23H28O11)不得少于1.8%。
5.3.5系统适用性试验
线性关系考察吸取上述对照品溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml,分别置25ml量瓶内,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取10μl注入液相色谱仪分析。
以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,结果见表12:
表12线性关系考察结果
芍药苷对照品(ug)
峰面积
精密度试验精密量取已知浓度的芍药苷对照品溶液10μl,按液相色谱条件,进样测定6次,结果见表13:
表13精密度试验结果
峰面积值
平均值
RSD(%)
稳定性试验取本品,制备供试品溶液,测定芍药苷于0、2、4、6、8、10小时内峰面积,结果见表14:
表14稳定性试验结果
时间(小时)
平均峰面积值
重复性试验取本品,一式6份,制备供试品溶液,测定样品中芍药苷含量,结果见表15:
表15重复性试验结果
样品量(g)
芍药苷含量(mg/g)
平均含量(mg/g)
加样回收率试验取已知含量芍药苷的本品6份,每份约10mg,精密称定,分别按样品中芍药苷含量精密加入芍药苷对照品,按供试品溶液制备方法制得供试品溶液,精密量取续滤液10μl,经HPLC分析,测定芍药苷含量,计算回收率,结果见表16:
表16加样回收率试验结果
取样量(g)
样品中芍药苷量(mg)
芍药苷对照品加入量(mg)
芍药苷测得量(mg)
回收率(%)
平均回收率
5.4水分
按《中国药典》2015年版四部通则0832的第二法项下操作,取本品粉末约1g,平铺于恒重的扁形称量瓶中,厚度<5mm,精密称定,打开瓶盖100~105℃,烘5小时,盖好,移至干燥器中冷却30分钟,精密称定,同样温度下在烘1小时移至干燥器中冷却30分钟,精密称定。
直至连续两次称定重量之差<5mg为止。
按减失重量和称样量计算供试样品中水分含量(%)见表17。
表17水分含量
样品编号
水分含量/%
平均含量/%
5.5炽灼残渣
按《中国药典》2015年版四部通则0841进行炽灼残渣的检测,取本品粉末约1g,置已炽灼至恒重的坩埚中,精密称定,缓缓织灼至完全炭化,放冷至室温;
加硫酸0.5ml使湿润,低温加热至硫酸蒸汽除尽后,在500~600℃炽灼使完全灰化,移置干燥器内,放冷至室温,精密称定后,再在500~600℃炽灼至恒重。
表18炽灼残渣
炽灼残渣/%
平均值/%
5.6重金属检查
取本品1.0g,按《中国药典》2015年版四部通则0821重金属检查法二法炽灼破坏,检查3批样品,并同时做空白试验,标准管含Pb10ppm。
表19重金属限量
重金属限量
6工艺流程
赤芍药材(50g)
根据药典方法检查药材质量
70%乙醇加热回流提取,
设计正交试验
确定最佳提取工艺参数提取药材,
得到提取液
减压浓缩,回收乙醇
浓缩液
加水溶解,过滤定容
药液
采用单因素试验筛选纯化工艺参数
确定最佳纯化工艺参数
最佳工艺醇洗脱液
减压浓缩
赤芍总苷
对赤芍总苷进行质量检查
7实验进度及安排
日期
实验进度安排
12月11日
药材薄层鉴别
药材含量测定
提取工艺试验1-7
试验8-9
12月18日
纯化工艺
12月25日
赤芍苷薄层鉴别
赤芍苷含量测定
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