G418 转染实例汇总Word格式文档下载.docx
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进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。
一般要求,6孔培养皿(35mm),每孔1-2ml培养基3×
105细胞。
依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。
典型贴壁细胞平板密度
培养板大小
生长面积(cm2)
大约细胞数
培养基容积(ml)
组织培养皿(φ60mm)
28
6.6×
105
5-6
6孔培养板(φ35mm)
9.5
3×
1-2
12孔培养板φ22.6mm)
4
1.3×
0.5-1
24孔培养板(φ8mm)
0.5
0.6×
0.25-0.5
3、SHG-44细胞的转染:
(1)转染当天,加入脂质体/DNA混合物之前的短时间内,更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。
(2)准备不同比例的DOSPER/DNA混合物,以确定每个细胞系的最佳比例。
①溶液A:
用HBS稀释DNA(pcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg到总体积50μl(30μg/ml)。
②溶液B:
用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl(120μg/ml)。
③混合溶液A和B,轻柔混合(不要振荡),室温孵育15min,以便脂质体/DNA混合物形成。
(3)不要移去培养基,逐滴加入100μl脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边),边加边轻摇培养板。
(4)37℃孵育6hr。
(5)6hr后更换转染培养基,加入2-3ml新鲜生长培养基。
(6)转染24hr后施加筛选压力,改用含G418的培养基培养。
4、G418筛选:
在G418筛选浓度下持续培养14天后,挑出单克隆,扩大培养,同时转染pcDNA3即SHG-44-vect,并设对照组细胞即SHG-44。
(一)筛选结果鉴定:
(1)基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因
(2)SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。
(3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响
①流式细胞仪分析:
SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
②细胞生长曲线测定:
SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×
104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析:
SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染,所用溶液滤过灭菌,以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。
但是,脂质体以及脂质体/DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体/DNA与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基,可提高转染效率,但所用培养基必须37℃预温。
4、脂质体/DNA混合物应当逐滴加入,尽可能保持一致,从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。
常见问题和解答:
Q:
我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。
A:
也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好.因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?
请问一种细胞如果转染了稳定表达的,含neo抗性基因的质粒后,如何用G418筛选?
我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。
即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。
我自己认为,从理论上讲,如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。
不知这种观点对不对。
然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定?
维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系?
1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/ml,每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ng/ml等12个级别,培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。
2。
我们掌握是传过10代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有G418,很快会形成优势的。
3。
即是有G418抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。
请问:
能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗?
转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多,有的少,外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。
所以,要进行单克隆化操作,使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,也是对高表达细胞的保护。
操作用96孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200cell左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述,我就不赘述了。
必须指出,单克隆化要做几遍,一遍是不够的,我前十代都是这样的,结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。
现在很多代了,很稳定。
1。
我的质粒中含有SV40与neo基因,好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。
2。
按您的讲法,筛选要进行10代,那么维持剂量要进行多长时间?
如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗?
3。
在细胞用胰酶进行传代时,此时细胞膜受到一定影响,如果培养基中存在G418对细胞是否有影响?
4。
既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响?
1.可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过FISH验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位DNA立体结构都是相关的,装入了SV40只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。
按你的讲法,转染完GFP的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。
neo基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。
有时,neo表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。
那为什么还要筛选基因?
是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为0的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。
打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓100个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?
应该是很小的。
红球就是neo,黄球就是你的目的基因。
我们用neo,实际上是筛选的外源基因整合的数目,怎么说呢?
用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,的二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。
因为二者出现的概率比是恒定的。
维持就是只要养这种细胞,就要维持。
可以再低些,但不能没有。
或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。
4。
neo的产物是酶,过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的G418液中生长速度也不同,严重形态也不同。
这就是酶与底物的比例关系嘛,这回不用数论的,用米氏方程理解吧。
5。
胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。
仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理,实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友,我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。
Anotheranswer:
1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关,如果整合发生在活性转录染色质区,则有利于表达。
通常用的载体是靠非同源重组随机整合的,所以为了获得高表达细胞株,需要对重组克隆进行筛选。
某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点,可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制,增强瞬时表达,有利于提高质粒的随机整合几率。
对普通的表达载体来说,即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合,表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。
关于概率论的思维,我认为红球和黄球的比喻很形象,但未必准确。
因为抗性基因和目的基因有一定的联锁,并不是完全相互独立的。
G418怎么配制?
我觉得不能用水配,因为这样PH会变化很大,至少要用PBS。
我是配在HEPES溶液中的,具体方法如下:
1g包装的G418瓶子中,加入10mlHEPES溶液,浓度为100mg/ml完全溶解后,0.22um过滤,-20度保存。
HEPES缓冲液配方如下:
90ml水中,0.8gNaCl,0.037gKCl,0.0135gNa2HPO4.2H2O,0.1g葡萄糖,0.5gHEPES,溶解,NaOH调PH至7.05,定容至100ml。
Goodanswer:
推荐用HEPES。
特别是当细胞对G418不敏感,G418使用浓度高时,如果用水、PBS配置,会极大的改变细胞培养基的pH值,影响细胞的生长。
1mol/LHEPES的简单配置:
HEPES11.91g,溶解于40ml的ddH2O,用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0,定容至50ml,0.22um小滤器过滤。
HEPES最终使用浓度15-20mM。
Q:
我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选,这样做可以吗?
我做过G418杀伤曲线,300ugml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1000ugml来筛选,不知是否可行?
会不会有什么问题?
A:
G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/ml,每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,11.00ng/ml等12个级别,培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好,会对细胞的损伤太大,影响增殖。
我用过Zeocin,为了加速筛选,用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到,欲速则不达。
我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度,确定最低致死浓度为600mg/l。
我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞,我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢?
在这期间可以换液吗?
筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中是否还应该加一定浓度的G418?
如果要加的话什么浓度比较合适?
应该保持这个浓度9天以上,每3天换液一次。
筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中应该加一定浓度的G418,一般在最低致死浓度的60%左右。
在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选,2周后单克隆形成,于是就挑取单克隆,之前6孔板里的细胞很多,用0.125%typsin+0.25%EDTA消化,1000转/分离心10分钟,肉眼可以看到细胞沉淀,接种至25ml塑料培养瓶中,镜下看密度可以,但是细胞形态成多态性:
少量是圆形,大多数是梭形。
第2天一看没有细胞贴壁!
做了2次都这样,请问我的操作步骤有问题吗?
看了你的操作步骤,个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆,在6孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡,少数细胞存活并逐渐生长,只能叫作克隆形成。
我们一般在转染后24h将细胞消化下来(0.25%trypsin+0.02%EDTA),以1:
10或更高的比例传代,贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。
待大部分细胞死亡,极少数细胞渐形成克隆。
再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。
从严格意义上来讲,单克隆化的操作一般要进行2-3次,经此操作后长起来的才能称之为单克隆。
另外,在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔,否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象,也可以在消化完用正常培养基,待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。
还有,在多克隆形成后一定要及时冻存,以备后续试验。
你挑选的克隆,不能贴壁原因可能有二;
一、细胞很少,那么你接种后,由于密度较低,细胞是接触生长,所以密度太低,细胞难以生存。
二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选,这样也会死亡。
消化后先用无G418的培养液培养,贴壁后,再换取G428培养液。
我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来,书上说用弯头吸管,我试了,不好用,根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来,我想着用刮勺,但进口的特别贵,所需又不多,你看有什么别的好办法吗?
谢谢了!
如何挑选克隆。
你可以按以下操作方法进行:
【操作方法】
(1)将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置,并将各个克隆位置用标记笔标记准确;
(2)在超净台内,弃去培养皿内的培养液;
(3)用镊子夹取一块滤纸块,用0.25%Trypsin消化液浸湿,置于所标记克隆位置处,5-20秒;
(有人可提前在一孔中装入0.02%EDTAPBS)
(4)将24孔培养板每孔加G418选择培养基2ml,用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快,置于一个孔中的培养基中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落下。
镜下观察确认细胞已经脱落后,将滤纸块取出弃掉,其它克隆方法转移同上;
(有人在细胞贴壁后再选用培养基)
(5)将移有克隆细胞的24孔培养板,继续置37℃5%CO2培养箱培养,2-5天;
(6)待细胞长满后,0.25%Trypsin消化液消化,并将细胞转移至6孔板继续培养,或转入多瓶中扩增,此后可做进一步鉴定工作。
用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了,已经在细胞瓶中扩大培养,但发现与正常HEp-2细胞相比,建系的细胞生长得很慢,细胞间的边界也不是很清楚,而且细胞长得不均匀,这样正常吗?
为改变这一状态,我该怎么做呢?
谢谢!
基本算正常吧。
稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化,有的很明显,比如说细胞变大,生长缓慢,细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;
有的则变化不明显。
对于稳定转染的细胞,建议筛出单克隆后大量冻存。
一方面防止细胞回复,因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担,细胞较倾向于甩掉负担轻装前进,这一点对于肿瘤细胞尤甚;
另一方面,如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话,这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。
在传代过程中,也可以使用正常培养基,但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压,以除去回复的细胞。
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G418筛选
星期二,十二月23rd,2008|默认分类|lixinnew027|浏览:
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1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/mL,每孔100uL加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ng/mL等12个级别。
培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。
2.我们掌握是传过10代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有G418,很快会形成优势的。
3.即是有G418抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。
操作用96孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200cell左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。
2.那为什么还要筛选基因?
打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓100个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?
用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,第二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。
3.维持就是只要养这种细胞,就要维持。
4.neo的产物是酶,过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的G418液中生长速度也不同,严重形态也不同。
5.胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。
在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了
本帖开始我就讲了如何确定基准浓度,筛选浓度是基准浓度的高一级,维持用筛选浓度的一半。
汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译,实际上就是指细胞占培养表面的比例,如果细胞铺满了整个容器,我们就认为它们100%汇合,也就是汇合度100%。
最近的一个实验是:
106细胞电转后,我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中,48小时后加g418筛选,这个时候接种了1/300细胞的孔会大约50%汇合,而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左右汇合,今天是筛选后第9天,观察到1/4000孔有两三个小克隆,按道理1/300孔会有20-30个克隆,但实际的情况是它们几乎全部死光了,仅有少数存活细胞!
所以我认为汇合度对g418筛选影响很大,这耽误了我将一个多月。
jiangql同意菊花与刀对你的建议。
我的感觉G418筛选时间太长,到后来一般会对细胞生长有影响。
以下是一些建议,供参考:
首先需要扩增细胞,冻存部分中间产物细胞后,再做克隆化比较合适,否则一旦污染就会全军覆没。
一般5~7天后G418就可以减半维持。
勤换液,去除死细胞,可以减少对存活细胞的影响。
血清浓度可以高到20%,质量要好。
进行真核转染的一般程序:
克隆目的基因(经测序验证)—准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定
G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL
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1.G418的配制:
取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中,加蒸馏水至10ml,过滤消毒,4度保存。
2.细胞培养:
取待测培养细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入多孔培养板中,培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基:
在100ug/ml~1000ug/ml范围内确定几个梯度,比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml,按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选:
吸除培养孔中培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液:
根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度:
在筛选10~14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大,最有可能的是出现这种情况:
用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞,而用
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