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易生物试剂库:
2)器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头
酒精灯
废液缸
血球计数板
涡旋振荡器
恒温水浴箱
台式离心机
35mm培养皿
转染管
15ml离心管
观察用倒置显微镜
荧光显微镜和CCD
易生物仪器库:
4.实验步骤
细胞传代
(1)试验准备:
200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。
(2)弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液,消化1分钟(37。
C,5%CO2)。
用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。
(6)将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。
细胞转染
1)转染试剂的准备
A.将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡,。
2)选择合适的混合比例(1:
1-1:
2/脂质体体积:
DNA质量)来转染细胞。
在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。
加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。
5)将混合液在室温放置10—15分钟。
6)吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。
7)加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。
8)到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
第二次细胞传代
1)在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2)再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。
3)在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
转染条件优化可以参考TransFast的使用说明书。
磷酸钙细胞转染技术
磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法,磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
[实验目的]
1了解细胞转染技术原理和基本方法
2磷酸钙沉淀法的基本技术要点
[实验原理]
磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法,磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。
这种方法首先由Graham和vanderEbb使用,后由Wigler修改而成。
可广泛用于转染许多不同类型的细胞,不但适用于短暂表达,也可生成稳定的转化产物。
[仪器、材料和试剂]
1 呈指数生长的真核细胞(如HeLa,BALB/c3T3,NIH3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞)
2 完全培养液(依所用的细胞系而定)
3 CsCl纯化的质粒DNA(10~50μg/次转染,二次纯化)
4 2×
HEPES缓冲盐水(HeBS)
(pH6.95~7.05) 50.0mmol/LHePes;
280mmol/LNaCl;
10mmol/LKCl;
1.5mmol/L葡萄糖。
用0.5mmol/LNaOH调pH至6.95~7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。
5 2.5mol/LCaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。
6 磷酸缓冲盐水(PBS)
7 37℃,5%CO2的加湿培养箱
8 100mm组织培养平板
9 15ml锥形管
[方法与步骤]
1 传代细胞准备 细胞在转染前24h传代,待细胞密度达50%~60%满底时即可进行转染。
加入沉淀前3~4h,用9ml完全培养液培养细胞。
2 DNA沉淀液的准备 首先将质粒DNA用乙醇沉淀(10~50μg/10cm平板),空气中晾干沉淀,将DNA沉淀重悬于μL无菌水中,加50μL2.5mol/LCaCl2。
3用巴斯德吸管在500μL 2×
HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液,同时用另一吸管吹打溶液,直至DNA-CaCl2溶液滴完,整个过程需缓慢进行,至少需持续1~2min。
4室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。
5将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中,轻轻晃动。
6在标准生长条件下培养细胞4~16h。
除去培养液,用5ml 1×
HeBS洗细胞2次,加入10ml完全培养液培养细胞。
7收集细胞或分入培养皿中选择培养。
[注意事项]
1在整个转染过程中都应无菌操作。
2为获得最佳实验结果,DNA应不含蛋白质和酚。
乙醇沉淀后的DNA应保持无菌,并在无菌水或TrisEDTA中溶解。
3沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打,以确保形成尽可能细小的沉淀物,因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
4在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都可能导致磷酸钙转染的失败。
磷酸钙-DNA共沉淀法(贴壁细胞转染)
此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
磷酸钙细胞DNA共沉淀法贴壁细胞转染细胞转染
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形成出现时,可使DNA黏附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%-5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳动物细胞进行暂时性表达或长期转化的研究。
1、配液:
2×
HBS1.63gNaCl;
1.19gHepes;
0.023gNa2PO4.2H2O;
加水至100ml(pH7.1),过滤,<
4℃保存。
2mmol/LCaCl2过滤除菌。
TE0.1mmol/LEDTA;
1mmol/LTris-HCl(pH8.0).
G418(新霉素G418)液1gG418溶于1mmol/LHepes缓冲液中,加水至10ml,过滤除菌,<
G418选择性培养基用含10%胎牛血清的DMEM培养基配制,G418浓度为200-800mg/L。
注意对受体细胞先做预实验,选用在10-14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。
2、操作步骤(方法一):
(1)供体DNA制备:
按前介绍的DNA提取法提取DNA,溶于TE中,40mg/L。
(2)受体细胞的培养:
研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。
如小鼠NIH-3T3细胞系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前1天接种细胞,接种密度为2×
104个/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃、5%CO2培养,待细胞占50%-70%瓶底面积时,用于转染试验。
(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备:
将供体细胞DNA和PSV-2neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同时想供体细胞DNA溶液200ul中加入新霉素基因的质粒DNA溶液(20mg/L)220ul和2xHBS250ul(PSV2-neo为1-2mg/L)。
取500ul上述DNA溶液加入硅化试管中,缓慢加入3.1mlCaCl2(2mol/L)混匀30s。
然后立即混旋,室温下静置30min,待溶液轻度浑浊后,吹打后即用于转染受体细胞。
(4)转染受体细胞:
将处于对数生长期已占瓶底50%-70%的受体细胞在转染前4h更换一次新鲜培养基,每瓶5ml(25ml培养瓶)。
吸取0.5DNA-磷酸钙沉淀,加入含5ml培养基的细胞瓶中摇匀。
置37℃、5%CO2培养24h或更长,使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。
更换新鲜培养基,继续培养24h,诱导转染基因的表达。
更换浓度为800mg/L的G418选择培养基进行筛选。
同时设有未能转染的对照细胞。
培养大约3-5天,对照细胞大部分死亡,这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基,每3-4天更换一次选择培养基。
2周后对照细胞死亡,在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现,待其增大后再进行克隆化和扩大培养。
可建立转化细胞株,并作进一步鉴定。
本实验要加入PSV-neo、DNA于外源DNA共转染受体细胞,这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性,这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”,也可测出转入的外源性基因的抗新霉素的标记。
而且还可利用被新霉素基因导入的受体细胞通过G418选择性培养基筛选转化的细胞建立细胞株。
Uoyi获取“转化灶”为目的,可不加入PSV2-neoDNA,只需将从癌细胞中提取的基因组DNA导入受体细胞即可,方法如下。
3、基因组DNA转染(方法二):
配制磷酸转染。
NaCl8.0g,Hepes5.0g;
Na2HPO40.099g;
加温水至1000ml。
用时现配,pH很重要,一定要控制在6.95±
0.65,消毒灭菌,-20℃贮存备用。
按前面介绍的方法提取癌细胞基因组DNA。
取供体基因DNA50-100ug,加3mmol/LNaCl或醋酸钠,使最终浓度至0.3mmol/L,混匀。
再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10min,弃上清。
加入转染缓冲液,待DNA充分融解后,夹在如2.5mmol/LCaCl2,终浓度为125mmol/L,用吸管吹打3次,置室温下10-30min,待液体透明度降低,出现微浊蓝色时,即可用于转染细胞。
取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞,在转染前4h,更新培养基一次。
转染。
向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5-1ml,置37℃作用4-6h。
培养。
弃去培养基,用15%甘油处理3min,无血清培养基漂洗1次,接近汇合时血清用量降至5%,培养2-3周。
检测。
逐日观察,待出现“转化灶”后,克隆分离,扩大培养建立转化细胞株。
细胞转染需要注意的几个问题
转染是否成功的影响因素很多,如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此),需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质),转染试剂等。
但无论在何种情况下,转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及
细胞转染细胞
但无论在何种情况下,转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。
细胞:
分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。
因此对大多数转染操作而言,细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;
此外,还常用促有丝分裂刺激物(如,病毒转化,生长因子,条件培养基,以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。
贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。
相对于贴壁细胞(如HEK,CHO),悬浮细胞(如HL60,Jurkat)非常难以转染,可能是因为细胞间膜结构的差异,但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前,必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。
这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。
因此分批方案的不同(如,胰蛋白酶消化时间的长短,胰蛋白酶的灭活等)需要优化。
传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。
某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定,可能会随着培养时间的延长而改变,视不同的细胞系和培养条件而定。
因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。
一般而言,细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。
细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间,细胞就会按指数规律分裂。
对于正常细胞而言,细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制),但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。
营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。
细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。
报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。
培养物污染——培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。
各种污染都会导致产生错误的结果。
支原体污染——支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%,它可改变细胞生长特性,酶的作用途径,细胞膜的组成,染色体结构,以及转染效率。
特别是,支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰,其结果致使非典型转染或转染效率偏低。
这些影响会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。
和细菌及真菌不同,支原体污染无法通过视觉检查发现。
它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜;
它们还对常用抗生素有抗药性。
所以必需进行支原体污染的常规筛查。
交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞,那就有可能发生交叉污染,即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。
如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。
和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。
如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种,几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
载体DNA
一般原则:
对纯化所得的载体进行质量鉴定。
确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。
在测定细胞体系的参数时,一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。
载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。
转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解,以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。
载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。
制备产物中残余的污染物(如CsCl,内毒素)可能会影响转染效率。
载体构造(启动子/增强子/ORI)—转染体系通常用带有强病毒调节元件(如,RSV,CMV,和SV40)的对照载体进行优化和比较。
然而,病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。
例如,在某些细胞系中,由于自发的质粒扩增,SV40体系可高效表达largeT抗原(如,COS);
而在其他许多细胞系中,则是CMV启动子更为有效。
除此之外,各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异,这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。
组织培养试剂
优化您的细胞生长条件。
只使用新鲜配制的培养基和添加剂,并尽可能减少所用试剂的变更。
基础培养基——培养基的成分包括营养物质(氨基酸,葡萄糖),维生素,无机盐,和缓冲物质。
有些成分非常不稳定,因此如果在使用时不是新鲜,加入就可能会产生问题。
配置时要使培养基务必避光保存;
因为已知有一些组分和缓冲物质,如HEPES,当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。
胎牛血清——血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。
采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量,从而引起显著生物学变化。
添加剂——某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质(如,生长因子,微量元素,必需代谢物和蛋白等)。
CO2培养箱——细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95%的CO2培养箱。
用CO2是为了控制pH值,细胞生理对pH的变化非常敏感,因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。
有些培养基需要CO2浓度为5%来有效控制pH值,而另一些则需要10%的CO2。
需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。
如果培养箱内培养条件与所需条件不一致(温度、湿度和CO2)则会导致实验结果的板间变异。
来自于培养箱内的污染物、化学物质,或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理。
使用瞬时转染来生产蛋白瞬时转染表达蛋白
以往为了获得蛋白质的高表达产量,必须先转染细胞,然后挑选一个稳定的转染细胞系进行蛋白的扩增和富集。
而挑选这样一个细胞系往往需要花费数周甚至数月的时间,这既可能是由于试剂的细胞毒性也可能是由于转染的低效率。
如果是因为转染试剂具有细胞毒性,那么只有少数细胞能够存活,从而导致蛋白质的产量很低。
而如果是因为转染成功的细胞太少,那么那些未转染的细胞生长速度大大超过转染成功的细胞,其结果同样也只能产生少量的目标蛋白。
使用一种温和的可以转染大多数细胞的转染试剂,就可获得蛋白质的高表达。
现将一些影响蛋白高效表达的关键因素分列如下:
细胞系(有些类型的细胞比其他细胞产量高)
质粒骨架(例如:
增强子,启动子,转录调控元件)
目的蛋白(有些蛋白很难获得高表达量)
目的蛋白的cDNA序列(例如:
密码子的优化)
培养条件(营养物,代谢废物,转染抑制物)
当这些因素都得到优化,并加入合适配比和数量的转染复合物(转染试剂-质粒)后,就可获得至少达到平均表达水平的稳定表达克隆。
瞬时转染和稳定转染
制备一种稳定细胞系的第一步是选择一种同时含有选择性标记物和目的基因的载体。
选择性标记物通常是可以产生一种蛋白质或者酶来帮助细胞在某些毒性物质存在下存活的基因。
一旦选好了质粒载体,无论瞬时或者稳定表达都采用一样的转染方法。
在加入选择性试剂之前,被转染的细胞至少要在标准培养基中培养过夜。
这样就使细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受选择性试剂的作用。
细胞于是在加有选择性试剂的培养基中生长。
那些未成功转染质粒的细胞即被杀死。
而只有那些成功转染的细胞能够生长。
有的时候,还可以将选择性试剂持续加入到培养基中,以维持对细胞的选择压力。
转染方案
建立一套适当的转染方案;
首先从一种标准方案开始,然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。
转染复合物的制备——诸如转染试剂/DNA配比,离子强度,缓冲液pH值,以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。
质粒可用无菌水或TE缓冲液稀释。
如果您要使用一种市售的转染试剂,就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。
在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;
如果制备复合物所使用的培养基含有血清,它就会对转染产生抑制。
制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节,对于不同的转染试剂而言可能差别很大。
转染试剂/DNA配比(负载比)——所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。
有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄;
而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。
形成转染复合物所用的稀释剂——对于多数试剂而言,很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基或盐溶液中形成。
转染复合物的加入——有两种替换方法可用来将转染复合物加入转染细胞:
1.将复合物浓缩液逐滴加入培养基,或者2.将转染复合物先用培养基稀释,然后进行培养基更换操作。
第一种方法更简便,而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性,所以会使结果的一致性更好。
时间进度
一般原则提示:
要确保最终结果的成功;
建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。
转染的开始——在转染前12小时,将细胞分种于培养板中。
在细胞达到50-80%的融合率时开始转染,这样就可以使它们在实验结束时达到接近100%的融合。
细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。
在这段时间后,就不会再发现转染效率有所增长。
培养基更换——某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。
如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行,那么这一步骤就必不可少。
而对于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂时,如果有足够的培养基用于后续表达阶段,就可以省略这一步。
如果将转染复合物留在培养基中直到进行检测,那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高,而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。
虽然在转染步骤之后转染试剂/DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除,但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。
如果转染细胞需要生长3-7天,换培养基就尤其重要,这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。
时间测定——转染开始后的24-48小时内,报告基因产物的浓度逐渐增加;
而这种增加取决于增强子的强度、表达外源蛋白中所涉及的细胞反应,存活细胞的健康状态,以及营养因素等。
在转染后等待3-7天收集蛋白进行纯化较为常见了。
最后就是平时可能会忽略的转染试剂本身的脱靶效应off-targeteffect,转染试剂本身对基因表达水平(高表达或低表达)的影响,有时候可能会造成
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- 细胞 转染 实验 原理