WB灰度值测定Word格式.docx
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WB灰度值测定Word格式.docx
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4、analyze→Gels→selectfirstlane→Gels→plotlanes(在这第四步也可以分开选取,如:
框选第一个条带→analyze→Gels→selectfirstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→selectnextlane)
5、选中直线工具,将开口波峰关闭
6、选中魔棒工具(正数第七个),点击波峰,就得出所有area值。
方法二
1、打开ImageJ软件→左上角file→Open选择自己的条带图片(事先条带弄正)
2、把图片转化成灰度图片:
3、扣除背景:
Process→SubtractBackground→50pixels并勾选LightBackground
5、设定参数:
Analyze→setmeasurement→勾选Area、Meangrayvalue、Min&
maxgrayvalue、Integrateddensity
6、Analyze→setscale→unitoflength选项里改为pixels,确定
6、图像分割。
Edit→Invert→选中椭圆圈(手残党首选)/不规则圆圈(心灵手巧党义无反顾),手动圈上单个条带
7、Analyze→Measurement即得到Intden,重复6、7步就得到所有Intden值
小伙伴们,你们是哪种方法呢?
首先先把结论说出来,其实两者得出的area和Intden严格来说都不是灰度值,前者是面积而后者是光密度值,但用来量化WB条带都是OK的。
ImageJ这个软件在将westernblot条带量化时存在两种参数:
灰度与光密度(假,暂且这么称呼,原因下文再说),这两者在理解使用ImageJ量化WB条带十分重要,请务必仔细看以下几个概念.
1、灰度(gray):
是指图像中各种颜色的深浅程度,它以整数值表示,一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为0—255共256级,每一像素点对应的数值即灰度,灰度值越小物体颜色越深。
有兴趣的小伙伴,可以随意用ImageJ打开一张图片,光标在图片上任意移动,得到的value值最小为0(纯黑),最大为255(纯白)。
2、光密度(OD,真):
也就是吸光度(A),光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg(Io/Ib),其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。
明确这两个概念后,我们再来看为什么称ImageJ里的光密度是“假”,因为在图像分析中的光密度(假)是由灰度值再经计算得到的,它是一个相对值,但其算法与OD值的算法类似。
只是它的入射光强度由Westernblot胶片上最亮区域的平均灰度值代替,而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。
即:
图像分析系统的光密度值=lg(WB胶片上最亮区域的平均灰度值/待测目标的平均灰度值),再简单点来说,就是光密度(假)和正儿八经的灰度值有血缘关系。
总结起来说灰度与光密度(假)都能用来量化westernblot条带,两种量化任君随意挑。
现在说回两种操作方法:
方法一:
是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线,最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小.条带越大,area值越大。
方法二:
是通过上文说到的光密度(假)计算方法得出来的,最后得出的Intden值是所圈面积下的总光密度值,再除以圈下面积area,得出的是平均光密度值(图像中阳性区域每一像素点的OD值叠加后除以测量的面积)。
条带(颜色反转后)越白越亮则Intden/area越大。
所以严格意义上来说,方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值,但又与灰度值有着千丝万缕的联系。
如果只是量化WB条带,两种方法是都能选用的,记得标注你得到的结果是area还是Intden,但如果你想测出真正的灰度值,那么我们下节课再来好好谈谈,咦?
我说话怎么越来越像老师的风格呢,哈哈,同学们,下课。
今天主要讲述如何用photoshop测量WB灰度值,在讲述操作方法之余,小石头先给大家理一理原理,以便大家更好的理解(文末附操作方法)。
照例最先展示下最后的成果图(其实最后可以用Graphpad做图,在此不赘述):
好了,开始今天的课程,现在手里有张这样的WB条带图,如何将各条带灰度值测量出来?
首先我们从基本原理聊起,图片大小的存储基本单位是字节,每个字节是有8个比特(bit,音译为比特,也称为“位"
)组成.一般的图片都是由众多像素点构成的,灰度模式下一个像素一个字节,也同时就是8bit。
在上一堂课中,我们曾用ImageJ将图片转化为灰度图,就是通过image→type→8—bit这一步.如果把黑-灰—白连续变化的灰度值量化为256个灰度级,灰度值的范围也就为0-255,表示亮度由深到浅。
从上图我们可以得知纯黑为0,纯白为255,中间0-255代表各个不同亮度等级。
而通常我们所得到的WB图片是这样的:
前者A是没有转化为灰度模式的,后者B是灰度模式下的。
而在灰度模式下,如果按灰度值描述的话,显然有明显条带的的灰度数据基本都与0相近,数值很小,这样不利于互相比较。
所以通常的做法是进行“反相”,也就是将白的地方变为黑,黑的地方变为白,颜色颠倒。
也就是这样:
至此条带上的灰度值就成了越亮越白则灰度值越大(有没有小伙伴看过那种原始照片底片,记不记得底片上人物的头发都是白的发亮,这种就是灰度值255哦;
还有做电泳凝胶的小伙伴,得到的凝胶图就不需要反相了,可以直接进行灰度值分析哦)。
我们目前要想测量条带的灰度值,就只需把那发光发亮的地方圈出来,读取灰度值就可以了,而这一部分就交给photoshop来计算吧。
在这里小石头想敲敲黑板,提醒大家注意下三点:
1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值,而在比较WB条带灰度值时,我们还应考虑面积的关系,以面积与平均灰度相乘得出的总灰度,我们才能更准确地得出条带之间的表达差异。
2、条带上得出的数据其实是相对于背景而言的,这个背景虽然反相之后非常黑了,但毕竟不是全黑的,我们还需要扣除背景的灰度值.并且,背景尽量干净,这就要求我们在做WB时多努力了。
3、不同图片的背景是不一样的,不同图片的WB条带是不能进行相互比较的哦。
接下来附上Photoshop测量WB条带的灰度值的操作方法,其中每一步的意义基本已在上文所介绍,对哪一步操作有不明白的小伙伴可以回过头再看看的。
步骤1:
打开软件Photoshop→左上角打开图片
步骤2:
将图片转为灰度模式(如果已经为灰度,此步跳过):
图像→模式→灰度→扔掉
步骤3:
将条带摆正(两种方法)
通用步骤:
最左侧选取标尺工具→在条带上画一条自认本应水平的线
直接点击正上方“拉直图层”(此操作简便,但有可能使边缘条带挪出界外)
方法二:
图像→图像旋转→任意角度→确定
步骤4:
得到的灰度图进行适当调整:
图像→调整→色阶→调整下图中三个点,适当将自己的WB图片转成黑白对比稍明显的样子,如图(此步也可通过更改亮度/对比度实现:
图像→调整→亮度/对比度)
步骤5:
反相:
图像→调整→反相
步骤6:
最左侧多边形套索工具→延条带边缘圈选→图像→分析→记录测量(分析→选择数据点可以只显灰度值-平均值和面积),依此步依次测量各个条带,同样的方法选取任意一个背景测量背景灰度值.
步骤7:
导出数据,进行处理
结语:
也许有小伙伴会提出这样测出的灰度值存在差异,在此提出的解决方案是可以与内参进行比较取相对值,或者多次独立测量以及实验.而对WB条带量化,可以参照上堂课用ImageJ软件,今天主要还是讲述Photoshop与灰度值。
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- WB 灰度 测定
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