食品微生物检验技术实验指导Word文档下载推荐.docx

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MgSO4·

7H2O 

FeSO4、NaCl等

2、仪器

天平、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱

3、玻璃器材及其它

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、药匙、玻璃漏斗、pH试纸（5.5-9.0）、棉花、牛皮纸、记号笔、棉线、纱布、吸管（1ml）、培养皿、玻璃珠。

四、方法步骤

（一）、配制培养基

配制培养基的制备与分装步骤

1、称量 

除琼脂外，按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入适当大小的烧杯中。

蛋白胨极易吸水，称量时动作要快。

补足所需水分，混匀后加入琼脂。

2、加热溶解 

向烧杯内加入所需水量的一部分，放到电炉上加热，同时不断进行搅拌，使其溶解，最后补足所需水分。

加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。

3、调pH值 

用精密pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。

4、加入琼脂融化 

向溶液中加入所需的碎琼脂，在电炉上一面加热一面搅拌，直到琼脂完全融化后才能停止搅拌，并加入热水补足水分。

5、过滤 

用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。

用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。

没有悬浮物的不用过滤。

6、分装将培养基趁热加至漏斗上进行分装。

如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中，装试管时，装量不要超过试管的1/4；

如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于三角瓶或锥形瓶内，一般以其容积的1/2为宜。

注意管口不要沾上培养基。

在漏斗下口处套有一段透明胶管，胶管下部用弹簧夹夹紧。

分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。

分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。

7、加塞、包扎、标记加上塞子，然后在外面用一层牛皮纸包扎。

试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。

分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。

堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。

棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。

棉塞做成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。

棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。

棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。

塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，准备灭菌。

（二）、培养基及器材的灭菌

杀菌操作流程：

检查杀菌锅各部件是否正常→加水→装锅→加盖密封→通电加热→排空气（大量蒸汽排出时，维持5min）→升温→恒温杀菌→断电降温→开盖→取出物品

培养基、无菌水等，放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌。

1、含糖培养基：

115℃灭菌10min或113℃灭菌15min

2、无糖培养基：

121℃灭菌15～20min

玻璃器皿：

干热灭菌，放入烘箱加热灭菌：

160～165℃灭菌2h；

或湿热灭菌：

121℃灭菌20～30min。

五、思考题 

1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？

如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？

2、加压蒸汽灭菌的原理是什么？

是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？

为什么？

3、干热灭菌应该注意哪些事项？

4、管口、瓶口为什么要用棉塞？

能否用木塞或棉皮塞代替？

实验二酱油中菌落总数的测定

一、目的要求

1、了解细菌总数检验的意义。

2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法

3、掌握国际法测定菌落总数的方法和技能

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。

菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

三、实验仪器与材料

恒温箱、水浴锅、天平、可调式电炉、试管、吸管、三角平等

营养琼脂、生理盐水、样品（酱油、乳粉）

四、实验程序与步骤

（一）、基本操作过程：

样品称量→样品稀释→倾注平皿→培养24小时→计数报告。

（二）、样品的稀释（样品的处理）

样品：

酱油

外包装消毒→无菌称样品25g→加无菌生理盐水→加盖振荡摇均匀

1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。

以无菌操作吸取检样25ml，放入含有225ml灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量玻璃珠），经充分振摇做成1:

10的稀释液。

若为固体检样，在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：

10的均匀稀释液。

2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。

3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。

4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。

5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。

注意：

①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。

②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。

③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。

④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。

（三）、倒平板

稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。

①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。

②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。

（四）、培养

待琼脂凝固后，翻转平皿，置36±

1℃温箱内培养24h后取出，立即计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

（1） 

琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。

（2） 

如果把不能立即计数，要将平板放入0～4℃冰箱中，但不能超过24h。

不同产品菌落总数测定的培养时间：

肉、乳、蛋及制品：

37℃培养48h

水产品：

30℃培养48h：

清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等：

37℃培养24h

1、食品检验为什么要测定细菌菌落总数？

2、食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？

3、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持地（46±

1）℃的温度？

4、培养时为什么要把培养皿倒置培养？

实验三鲜肉中大肠菌群的测定 

1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。

2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

一般认为该菌群细菌可包括：

大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。

它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the 

most 

probable 

number-简称MPN）表示。

显微镜、恒温箱、水浴锅、天平、可调式电炉、试管、吸管、三角平等；

乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管、革兰氏染色液、生理盐水、鲜肉等

四、方法与步骤

程序：

样品处理及初发酵接种→EMB平板分离→乳糖发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验→观察乳糖发酵结果

（一）样品处理及初发酵接种：

1、样品处理与稀释（无菌操作）

样品：

鲜肉

（1）先将鲜肉进行表面消毒处理，即沸水内烫3-5秒或烧灼消毒。

再用无菌剪刀剪取深层肌肉25克，放于含有225ml灭菌生理盐水的玻璃瓶内（内置玻璃珠），经摇床以8000-10000r/min的转速处理1min做成1:

（2） 

取一支1ml灭菌吸管吸取1:

10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管使其充分混合均匀，做成1:

100的稀释液

（3）按上法进行操作依次做成10倍递增稀释液。

2、乳糖初发酵试验（无菌操作）

根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管。

（1）用1ml移液管吸取稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中，每个稀释度接种3支，共接种9支。

（2）放入培养箱培养：

将接种后的乳糖胆盐发酵管置36±

1℃温箱内，培养24±

2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则可报告为大肠菌群阴性；

如有产酸产气者（培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡），则按下列程序进行试验。

（二）EMB平板分离

将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上（一管对一个平板），置36±

1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并挑取可疑菌落做：

革兰氏染色和证实试验。

在EMB平板上的典型菌落：

呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。

由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。

（三）乳糖复发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验

1、乳糖发酵接种

　　从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个同时接种乳糖发酵管，置36±

1℃温箱内培养24±

2h，观察产气情况。

2、进行镜检

从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色。

大肠菌群菌：

革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。

3、进行靛基质试验

向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂（欧—波试剂）0.5mL，静置片刻，观察液面。

阳性反应者，液面呈玫瑰红色；

阴性反应液面呈试剂本色。

则证实为粪大肠菌群阳性。

（四）观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗

1、观察乳糖发酵结果

观察：

乳糖发酵管内是否有气体产生

凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

2、查表报告结果

　　根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。

根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）粪大肠菌群的MPN值。

1、大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？

2、为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？

3、复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需要加胆盐？

4、所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”？

实验四鲜蛋蛋液中志贺氏菌及其检验

1、了解志贺氏菌生物学特性及原理

2、掌握志贺氏菌检验方法

志贺氏菌属（Shigella）的细菌是细菌性痢疾的病原菌，通称痢疾杆菌。

临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。

人类对痢疾杆菌有很高的易感性。

在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。

所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。

志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm,宽0.5-0.7μm。

不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。

志贺氏菌属的主要鉴别特征为：

无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。

志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。

1、恒温箱、水浴锅、天平、可调式电炉、试管、吸管、三角瓶

2、GN增菌液、EMB培养基、SS琼脂、三糖铁斜面、葡萄糖半固体培养蛋白胨水、5%乳糖发酵管、甘露醇发酵管、棉子糖发酵管、甘油发酵管、兔血浆、多价血清和26种因子血清

四、操作步骤

1、样品处理

无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。

2、增菌培养

放于36℃培养6～8h。

培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。

3、接种选择性平板及培养

取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；

另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。

放于36℃培养18～24h。

结果：

志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落

4、接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基

从SS、EMB琼脂平板、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。

一般应多挑几个菌落，以防遗漏。

经36℃培养18～24h，分别观察结果。

乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力

可以弃去的培养物：

（1）在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；

（2）在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；

（3）不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；

（4）产气的培养物；

（5）有动力的培养物；

（6）产生硫化氢的培养物。

5、血清学分型和进一步的生化试验

凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。

血清学分型鉴定：

从三糖铁琼脂上挑取培养物，做玻片凝集试验。

（1）先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；

（2）如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。

（3）如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。

福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。

可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。

　　第4步、4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。

如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。

进一步的生化试验

已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、甘油的发酵、靛基质试验。

（1）接种生化培养基

从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到：

5%乳糖、甘露醇、棉子糖、甘油、靛基质培养基中

（2）观察试验结果

志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。

但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。

志贺氏菌属四个群的生化特性

生化群

5%乳糖发酵

甘露醇

棉子糖

甘油

靛基质

A群：

痢疾志贺氏菌

－

（＋）

－／＋

B群：

福氏志贺氏菌

＋

C群：

鲍氏志贺氏菌

D群：

宋内氏志贺氏菌

+/（+）

d

注：

＋阳性；

－阴性；

－／＋多数阴性,小数阳性;

；

（＋）迟缓发酵；

d有不同生化型

结果报告：

综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告

五、思考题

1、志贺氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？

解释这些现象？

2、志贺氏菌检验有哪5个基本步骤？

实验五午餐牛肉罐头中金黄葡萄球菌的检验

一、目的要求：

了解金黄葡萄球菌的生物学特性

掌握金黄葡萄球菌检验原理和检验方法

二、实验原理：

金黄葡萄球菌耐盐性强，在100-150g/L氯化钠培养基中能生长，适宜生长的盐浓度为5-7.5%，可以利用这个特性对金黄葡萄球菌增菌，抑制杂菌。

金黄葡萄球菌可产生溶血素，在血平板上生长，菌落周围有透明的溶血环；

可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱，所以在baird-parker（含卵黄和亚碲酸钾）平板上生长，菌落为黑色，周围有一浑浊带,在其外层有一透明圈，利用此特性可分离金黄葡萄球菌；

金黄葡萄球还可产生凝固酶，酶可使血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不溶解的纤维蛋白，使血浆凝固，这是鉴定致病性金黄葡萄球菌的重要指标，是否是致病的金黄葡萄球菌主要看它是否产生凝固酶。

三、实验试剂及器材：

1、培养基与试剂：

胰酪胨大豆肉汤；

75个/L氯化钠肉汤；

血琼脂平板；

baird-parker平板；

肉浸液肉汤；

灭菌盐水；

兔血浆

2、器具及其他用品

显微镜；

恒温箱；

离心机；

灭菌吸管；

灭菌试管；

均质器；

载玻片；

L型涂棒；

酒精灯；

接种环等

四、实验内容

1、检样处理与增菌培养

称取25g固体样品；

吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。

　　吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨豆肉汤50mL培养基内，置36±

1℃温箱培养24h。

在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长

2、平板分离

用接种环将增菌液划线接种于血平板和baird-parker平板，（36±

1）℃培养24h，

血平板：

菌落成金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（β型）

Baird－Parker平板：

圆形、光滑凸起、湿润、直径为2-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。

用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。

3、革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验

挑取金黄色葡萄球菌可疑菌落进行革兰氏染色。

为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5-1μm

如发现葡萄球菌,再做血浆凝固E试验

吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入于8mm×

100mm试管内，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±

1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。

同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照

4、结果报告

（1）初步报告：

根据血平板培养计数和镜检，如发现有G+葡萄串状球菌存在，且有溶血性，则初步报告为：

“有金黄色葡萄球菌存在，1g样品约含多少。

”

（2）结果报告：

根据培养特性、镜检、生化试验、动物试验结果，可报告为：

“是否是致病性葡萄球菌”.

五、思考题

1、金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征如何，说明其原理。

2、金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征如何，说明其原理。

3、确认葡萄球菌为金黄色葡萄球菌的依据至少应包括哪几个试验？

4、金黄色葡萄球菌的形态与染色、培养特征如何？

实验六霉菌和酵母菌的检验 

（9课时） 

1、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能

2、熟练无菌操作技术。

　霉菌和酵母可造成食品腐败变质。

有些霉菌的有毒代谢产物能引起急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。

一次大量食入或长期少量食入，均能诱发癌症。

目前已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌在自然界中分布较广，对食品的侵染机会较多。

因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。

目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。

我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。

高盐察氏培养基生理盐水、样品（酱油、乳粉）

（一）基本操作过程：

样品称量→样品的稀释→倾注平皿→培养5天→→计数报告。

（二）样品的稀释（样品的处