半边莲提取物的抑菌效果研究Word文档格式.docx
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2.2.6菌悬液浓度测定5
2.2.7滤纸圆片法测试6
2.2.8细菌最小抑菌浓度的测定(MIC)7
第3章实验结果与分析8
3.1菌悬液浓度的测定8
3.2半边莲提取物对六种菌的抑制作用9
3.3半边莲提取物最低抑菌浓度(MIC)的确定10
第4章结论与讨论12
4.1结论12
4.2讨论12
参考文献14
附录16
致谢17
摘要
本实验主要采用了滤纸片法、试管两倍稀释法、平板划线分离法、平板菌落计数法等方法对半边莲的抑菌效果进行了研究,研究结果表明半边莲提取物为1.0g/mL时大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌、酵母菌抑菌圈直径分别为21.3mm、19.2mm、16.4mm、15.6mm、12.5mm、12.0mm。
根据最小抑菌浓度的测定可知半边莲提取物对大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌四种细菌的最小抑菌浓度分别为12.5mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。
因此半边莲提取物对革兰氏阴性细菌的抑制效果要强于对革兰氏阳性细菌的抑制效果,对真菌的抑制效果最差。
【关键词】半边莲;
黄酮;
抑菌;
提取
StudyontheInhibitoryEffectofExtractfromLobeliaChinensis
Abstract
FourmainmethodswereadoptedtoexaminetheinhibitoryeffectsofLobeliaChinensis:
Filterpapermethod,Twotimesdilutionmethod,StreakplatemethodandPlatecountmethod.Researchresultsshowthatwhenextracting1.0g/mLofLobeliaChinensis,thebacteriostaticdiameterofEscherichiacoli,Bacillustermo,Staphylococcusaureus,Bcillussubtilits,penicillium,andSaccharomycescerevisiaeis21.3mm,19.2mm,16.4mm,15.6mm,12.5mm,12.0mmrespectively.Accordingtotheassessmentoftheminimalinhibitoryconcentration(MIC),theMICofLobeliaChinensisextractonEscherichiacoli,Bacillustermo,StaphylococcusaureusandBacillussubtilisis12.5mg/mL,12.5mg/mL,25mg/mL,50mg/mLrespectively.Therefore,thisexperimentconcludesthattheextractofLobeliaChinensishasstrongerinhibitoryeffectsongram-negativebacteriathanongram-positivebacteriaandhastheweakestinhibitoryeffectsonfungus.
[Keywords]Lobeliachinensisalkaloidbacteriostasisextract
第1章绪论
1.1半边莲简介
半边莲(LobeliachinensisLour)为桔梗科多年生小草本植物,又名急解索、细米草、蛇舌草等。
被子植物门,双子叶植物纲,菊目,桔梗科,半边莲属,半边莲。
生于水田边、沟旁、路边等湿处。
产于华东、华南、西南、中南各地。
半边莲全草入药,具备利尿消肿,清热解毒等功效,可用于治疗大腹水肿、面足浮肿、痈肿疔疮、蛇虫咬伤等。
全草主要含生物碱,此外还有黄酮苷、皂苷、氨基酸、多糖等[1-6]。
1.2半边莲中的有效活性成分
半边莲中的有效成分主要有生物碱、黄酮类、皂苷、氨基酸等,此外还有琥珀酸钠、延胡索酸、对羟基苯甲酸钠和酚类等[7-10]。
(1)生物碱:
半边莲内主要含有的生物碱为山梗菜碱、山梗菜酮碱、山梗菜醇碱、异山梗菜酮碱。
这些物质具有中枢兴奋剂作用。
(2)黄酮类:
含有芹菜素、木犀草素、香叶木素等,黄酮类化合物的生理活性广泛,具有生物抗氧化性、消除自由基、抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂降血压、降低血糖、抗癌、镇痛、免疫、抗炎作用、抗菌和对消化性溃疡的保护作用等药用保健功能。
(3)皂苷:
具有镇咳祛痰平喘作用,还有抑菌功能。
(4)琥珀酸钠:
对热有较好的稳定性,溶解性能好,广泛用于方便面海鲜汤料、肉制品、酱油、海鲜类产品、调味品、腌制咸菜等
(5)延胡索酸:
用于制造聚酯树脂及多元醇,以及作为染料的媒染剂或是调味料。
它是一种普遍的食物添加剂及膳食补充剂,且有时在饮料或发酵粉中作为酒石酸的代用物
(6)对羟基苯甲酸钠:
广泛用于食品、化妆品、医药的防腐、防霉剂和杀菌剂等方面。
1.3半边莲的药理作用
(1)利尿利胆作用:
正常大鼠灌服半边莲浸剂,以及正常人口服半边莲粉剂,均有显著而持久的利尿作用。
尿量、氯化物排出量均显著增加。
半边莲水煎醇提物犬静脉注射有利胆作用,使胆汁流量增加两倍以上胆汁中固形物、胆酸盐、胆红素的浓度均下降[11]。
(2)对神经系统的作用:
半边莲碱对植物神经节、肾上腺髓质、延脑各中枢、神经肌肉接头以及颈动脉和主动脉体的化学感受器都有先兴奋后抑制作用,其作用与菸碱相似,但强度较弱。
半边莲所含的琥珀酸与戊巴比妥钠合用有协同镇痛作用,并能镇静和降低体温。
另有报道,半边莲碱可致吐,其原理既与延脑催吐化学感受区有关,亦有周围机制参与[12,13]。
(3)呼吸兴奋作用:
其水煎剂和生物碱能刺激颈动脉体化学感受器,反射的兴奋呼吸中枢。
剂量过大则引起呼吸麻痹而死亡。
半边莲碱吸入有扩张支气管的作用[14]。
(4)抗蛇毒作用:
小鼠注射最小致死量的眼镜蛇蛇毒,在半小时前灌服半边莲制剂及其所含的琥珀酸钠、延胡索酸钠、对羟基苯甲酸钠,均有较高的保护作用。
(5)抗溃疡作用:
本品所含的琥珀酸,可对抗大鼠幽门结扎产生的胃溃疡,是由于抑制胃液分泌和扩张胃肌而呈抗溃疡作用。
(6)轻泻作用:
半边莲煎剂口服,有轻泄作用,并能抑制食欲[15]。
(7)抑菌作用:
体外试验,山梗菜煎剂对常见致病性真菌有明显的抑制作用。
对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌亦有抑制作用。
(8)凝血作用:
腹腔注射给药可缩短小鼠断尾的出血时间。
1.4半边莲的研究现状
中药作为我国的传统医药,在应用上具有悠久的历史,在治疗因细菌而引起的感染类疾病中应用广泛,尤其是近年来中药复方制剂或提取物的应用进一步提高了临床疗效。
研究表明:
清热解毒中药抑菌作用肯定并且对一些耐药菌有一定抑菌和降低耐药性作用,对一些局部感染、肠道疾病、呼吸道疾病均有较好的疗效中药复方制剂作用优于单味中药,尤其中药注射剂与抗生素合用可以提高临床疗效。
并且中药还有天然无毒害、无残留、广谱抗菌、高效、成本低廉、技术依赖小等优势,这为中药在抗菌领域的全面推广奠定了基础。
半边莲在我国分布广泛,资源丰富,同时,半边莲中存在许多生理活性物质,具有抗菌作用,这为开发植物源天然食品防腐剂,抑菌剂研究提供了宝贵资源。
近年来,由于天然提取物的安全优势,从植物中提取活性物质是天然物质研究的热门课题。
研究表明,不同性能的抗菌剂间适当配合,可增强抗菌作用,这对于高效、广谱、无毒、天然食品防腐剂的寻找和筛选,对于农产品的深加工和促进食品工业的发展有着重要的科学意义和应用价值[16,17]。
目前针对半边莲提取物对各种类微生物的抑制效果差异性方面的研究非常缺乏,主要集中在对它的药理方面、临床应用和其内物质的提取工艺的研究较多。
如黄礼德[18]等人研究的半边莲不同提取物镇痛抗炎作用得出结论:
半边莲具有一定的镇痛抗炎作用,其镇痛抗炎作用可能涉及中枢及外周神经系统,而生物碱类和黄酮类物质可能是半边莲提取物镇痛抗炎的药效部位。
但对该药的具体作用机制不详,待进一步深入研究。
林雪群[19]等人研究的半边莲生物碱对高血压鼠脑动脉血管重构的作用得出结论:
半边莲生物碱可抑制高血压鼠脑基底动脉ET-1蛋白及ET-1mRNA的表达,提示半边莲生物碱在预防和治疗高血压诱发的脑血管重构中有重要的作用。
对半边莲内物质的提取工艺主要集中在对其内生物碱、黄酮苷和多糖的提取上。
还有一些人对半边莲的化学成分展开了研究,如杨靖华[20]等人对半边莲的化学成分展开了较为全面的研究,通过对具体化学成分的分析了解了理论上的功能作用。
这为对半边莲在某一方面的研究奠定了一定的基础。
同时也有部分人员的研究涉及到了半边莲的抑菌效果,但几乎都是只涉及到半边莲提取物对细菌有抑制作用,而没有研究半边莲提取物对各种类型细菌的抑制效果差异[21]。
1.5研究的目的与意义
半边莲在我国是一种分布广泛,且容易采摘的中草药,具有一定的药用价值,现今国内外对半边莲的研究较多,但大部分都是在围绕半边莲内所含物质的提取、鉴定及单一药理作用,而对其本身无需过度处理就能达到抑菌效果的特性研究较少,本实验就是针对这一现象,对半边莲进行较为简单的处理并以此来直接研究其对不同种类的细菌的抑制效果。
本实验通过测得半边莲提取物对各种类细菌的最小抑菌浓度,以研究其对不同种类细菌的抑菌效果差异,从而总结出半边莲提取物对不同种类的细菌的抑菌优劣,以期在以后研究半边莲对新细菌的抑菌效果时提供一定的参考依据。
第2章实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验原材料
新鲜全株半边莲,湖南科技学院校外采集,洗干净待用。
2.1.2实验菌株
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、青霉菌、酵母菌。
青霉菌由选择培养基选择得到,其它菌由湖南科技学院生物实验室提供。
2.1.3试剂
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、硝酸钠,磷酸氢二钾,硫酸镁(MgSO4·
7H2O)、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖等,均由湖南科技学院提供。
2.1.4实验仪器与设备
表2-1实验主要仪器
仪器名称
仪器型号
生产厂家
电子分析天平
AUY-120
岛津国际贸易有限公司
电热鼓风干燥箱
WG-71
天津市泰斯特仪器有限公司
恒温光照培养箱
MJX-250B-Z
上海博迅实业有限公司
无菌操作台
ZHJH-1109
上海制成分析仪器制造有限公司
电热恒温水浴锅
DK-98-1A
自动型手提式灭菌锅
YXQ-LS-18SI
其它实验仪器还有:
实验电炉、酒精灯、玻璃棒、三角瓶、烧杯、吸管、移液管、吸耳球、试管、培养皿、漏斗、容量瓶、滤纸、打孔器、涂布棒、接种环、高精度pH试纸等。
2.2实验方法
2.2.1原材料的预处理
取一定量洗净的半边莲放入鼓风干燥箱,温度为50℃,干燥一段时间后取出,用剪刀将其剪碎,长度约为一厘米,留存待用。
2.2.2半边莲提取物的制备
称取经过预处理的干燥半边莲20g,以蒸馏水作为溶剂,按照料液比1:
50加入蒸馏水,用实验电炉在沸腾条件下加热,直至溶液蒸发至200mL,过滤,滤液再用实验电炉加热蒸发,蒸发至20mL时停止电炉加热,改用水浴加热,温度为80℃,直至蒸发为膏状物,冷却,密封,至于冰箱内备用。
2.2.3培养基的配置
蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值,使得pH值在7.2~7.4之间,加入琼脂,加热煮沸使琼脂溶化,分装于锥形瓶内,用棉花、牛皮纸包好用高压蒸汽灭菌锅加热至121℃经20min高压灭菌。
营养肉汤培养基的配制:
蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL。
将各组分混合、溶解后调节pH至7.2~7.4之间,分装于锥形瓶内,121℃高压灭菌20min。
察氏培养基的配制:
硝酸钠3g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁(MgSO4·
7H2O)0.5g,氯化钾0.5g,硫酸亚铁0.01g,蔗糖30g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。
将各组分混合、溶解后调节pH至7.2~7.4,分装于各试管、烧瓶内,121℃高压灭菌20min。
2.2.4样品的处理
准确称取膏状物样品5.0g,溶于以配置好的0.85%的生理盐水中,边加热边搅拌,使样品完全溶解,再加入生理盐水到5mL,配置成1g/mL样品溶液,置于紫外灯下照射1小时灭菌后备用[22]。
2.2.5菌种活化与菌悬液母液制备
(1)五种供试菌株的制备:
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、酵母菌5种供测试的菌种分别移接入相对应的培养基上平板培养,每种培养两皿。
细菌置于37℃恒温、95%恒湿培养箱内培养,酵母菌置25℃恒温培养箱中培养。
每种菌取一皿供测试试用,另一皿置于0℃~4℃冷藏备用。
(2)青霉菌的制备:
从发霉的橘子皮上挑取少量青色菌落在培养基上划线培养,待菌落长出来后选取符合青霉菌菌落特点的菌落再次接种入相应培养基培养,培养两皿。
置于25℃恒温培养箱培养。
一皿供测试试用,另一皿置于0℃~4℃冷藏备用。
(3)菌悬液母液的制备:
在无菌条件下,用接种环挑取活化后的菌体,放入装有5mL无菌生理盐水的试管中,充分振荡摇匀,制成菌悬液母液。
2.2.6菌悬液浓度测定
(1)大肠杆菌、变形杆菌菌悬液测定
测定方法为平板菌落计数法
①编号:
取无菌培养皿9套,分别用标签纸表明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5mL无菌生理盐水的试管,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
②稀释:
用1mL无菌移液管吸取1mL,准确放0.5mL以充分混匀的菌悬液母液(待测样品),加入标有10-1字样的试管中,此为10倍稀释,移液管中多余的菌液放回原试管中。
将10-1在手掌中震荡数下,使菌液充分混合。
另取一支1mL移液管插入10-1试管菌液中吸取1mL,精确的放0.5mL菌液于10-2试管中,此为100倍稀释,其余依此类推。
③取样:
用3支1mL的无菌移液管分别吸取10-4、10-5和10-6稀释菌悬液各1mL,放入相应的无菌培养皿中间,每个培养皿放0.2mL,移液管中多余的菌液放回原试管中。
④倒平板:
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中倒入熔化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约15mL,置水平位置迅速旋动培养皿,使培养基与菌液混合均匀(旋动时不宜用力过度,否者会使培养基荡出培养皿或溅到培养皿盖上)。
待培养基凝固后,将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
⑤计数:
细菌培养24h后取出培养培养皿,根据统计的菌落数,计算出同一稀释度3个培养皿上的菌落平均数,按下列公式进行计算:
C=a×
b×
5
C:
每毫升样品中菌落形成单位数
a:
同一稀释度3次重复的平均菌落数
b:
稀释倍数
(2)金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌、酵母菌菌悬液浓度测定
测定方法为涂布平板计数法
涂布平板计数法的基本操作与平板菌落计数法相似,不同之处在于涂布平板计数法是先将熔化培养基倒平板,待培养基凝固后编号,然后无菌移液管吸取以稀释好的菌液对号放在不同稀释度编号的平板上,每个平板只放0.1mL,并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台20~30min,使菌液渗入培养基表层内,然后倒置于适宜温度的恒温培养箱中培养,枯草芽孢杆菌24h后计数,金黄色葡萄球菌48h后计数,青霉菌、酵母菌5天后计数。
2.2.7滤纸圆片法测试
取一定数量的定性滤纸,用打孔器将其打成直径为10mm的圆片,放入干燥的平皿中,于121℃高压灭菌20min,冷却放入样品溶液中浸泡30min,在无菌操作台上沥去多余试液,用无菌镊子放在涂好菌液的培养基上。
每皿呈“+”形对称放置四张圆片,每种菌平行做两个样。
细菌置于37℃恒温培养箱内培养1天以上;
青霉菌及酵母菌于25℃培养5天以上。
培养结束后,用直尺测试培养基中抑菌圈的直径。
2.2.8细菌最小抑菌浓度的测定(MIC)
最小抑菌浓度(MIC)测定采用试管两倍稀释法测定。
即在无菌操作台上取无菌试管8支,第1管加1.8mL营养肉汤,第2~8管各加1mL营养肉汤;
以1mL无菌移液管吸取已稀释好的药物1mL,准确放0.2mL药液于第1支试管中,摇匀后用另一支移液管从1号试管吸取1mL入第2管中,依次倍比稀释至第7管,混匀后自第7管弃去1mL。
此时,管中药液含量比依次为1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640,第8管不加药物为对照;
各管均加入供试菌液0.1mL,混匀后置于37℃恒温培养箱培养24h。
结果判定:
肉汤清亮透明表示无细菌生长(-),肉汤少量浑浊表示有少量细菌生长(+),肉汤有部分浑浊或沉淀表示有部分细菌生长(++),肉汤有大部分浑浊或大量沉淀表示细菌大量生长(+++),以能抑制细菌生长的提取物最高稀释度作为其最低抑菌浓度[23,24]。
第3章实验结果与分析
3.1菌悬液浓度的测定
用平板菌落计数法和涂布平板计数法对六种菌悬液的浓度进行测定,结果见表3-1、表3-2、表3-3、表3-4、表3-5、表3-6。
表3-1大肠杆菌平板菌落计数结果记录(个)
稀释度
组数(菌落数)
1
2
3
平均
1×
10-4
520
688
632
613.3
10-5
60
69
54
61
10-6
8
4
5.7
表3-2变形杆菌平板菌落计数结果记录(个)
10-3
400
424
396
406.7
44
35
39
39.3
6
由表3-1可知大肠杆菌菌悬液母液浓度约为3.0×
107cfu/mL,将其稀释3×
104倍和3×
105倍后得到菌悬液浓度为1.0×
103cfu/mL和1.0×
102cfu/mL的大肠杆菌菌悬液,留存备用。
由表3-2可知变形杆菌菌悬液母液浓度约为2.0×
106cfu/mL,将其稀释2.0×
103倍和2.0×
104倍后得到菌悬液浓度为1.0×
102cfu/mL的变形杆菌菌悬液,留存备用。
表3-3金黄色葡萄球菌涂布平板计数记录(个)
892
800
720
804
73
85
88
82
10
9
表3-4枯草芽孢杆菌涂布平板计数记录(个)
710
760
756.7
65
90
67
74.7
7
7.7
表3-5青霉菌涂布平板计数记录(个)
920
875
850
881.7
110
80
91.7
11
表3-6酵母菌涂布平板计数记录(个)
525
486
500
503.3
55
52
50.3
5.3
由表3-3可知金黄色葡萄球菌菌悬液母液浓度约为8.0×
107cfu/mL,将其稀释8.0×
104倍和8.0×
102cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液,留存备用。
由表3-4可知枯草芽孢杆菌菌悬液母液浓度约为7.5×
107cfu/mL,将其稀释7.5×
104倍和7.5×
由表3-5可知青霉菌菌悬液母液浓度约为9.0×
106cfu/mL,将其稀释9.0×
103倍后得到菌悬液浓度为1.0×
103cfu/mL的青霉菌菌悬液,留存备用。
由表3-6可知酵母菌菌悬液母液浓度约为5.0×
106cfu/mL,将其稀释5.0×
103cfu/mL的酵母菌菌悬液,留存备用。
3.2半边莲提取物对六种菌的抑制作用
实验采用滤纸片法测得半边莲提取物对六种菌的抑制作用,将样品溶液配成2个浓度:
1.0g/mL,0.1g/mL,菌悬液浓度均1.0×
103cfu/mL。
测定抑菌圈的大小,比较抑菌效果。
结果见表3-7。
表3-7半边莲提取物对各微生物的抑菌圈直径(mm)
1.0g/mL
0.1g/mL
组号
大肠杆菌
21.0
21.6
19.1
19.4
变形杆菌
19.0
17.6
17.0
金黄色葡萄球菌
16.6
16.2
15.3
15.0
枯草芽孢杆菌
15.4
15.8
14.2
13.5
青霉菌
13.0
12.0
-
酵母菌
注:
“-”表示无抑菌圈出现。
选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌圈实物图见图3-1、图3-2。
图3-1图3-2
由表3-7可知,半边莲提取物溶液对6种供试菌均有一定的抑制作用,并且根据样品溶液浓度的不同抑制强度也有所变化,提取物对大肠杆菌的抑制效果最好其
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