细胞支原体污染Word格式.docx
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80~30~22
19811987-19931998
Germany-DSM
36
1990-1994
Argentina
65
1987
Israel
32
1986-1993
China
95
1990
造成支原体高污染率的原因为:
1.支原体size0.1~0.8um,无细胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.45um)
2.支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4.细胞流通间缺乏品管,造成实验室间的相互污染
5.研究或操作人员忽略污染问题
而支原体污染了来源:
1.
已受污染的细胞
2.
操作人员的疏失
3.
已受污染的培养基、血清
4.
操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛,实验室之操作人员的污染亦可能为污染源,须十分注意。
而万一细胞已受支原体污染时,最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃,以免污染其它洁净的细胞株。
但是若是坚持要作去除支原体污染,有以下几种方法,只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染:
1.抗生素处理:
BM-cyclin(Roche),MRA(mycoplasmaremovalagent,ICN),Ciprofloxcin(Bayer),Enrofloxacin(Bayer)
2.Nucleicacidmetabolites:
5-bromouracil,Hoechst33258,bromodeoxyuridine
3.Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意:
G设备方面:
使用已作支原体测试ok之细胞株
于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
使用不添加抗生素的培养基培养细胞
G检测方面:
定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
G实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
有关支原体污染之问题与回答:
o应如何避免细胞污染?
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
o如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?
直接灭菌后丢弃之。
o支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状?
不能。
除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
o支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。
故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
o侦测出细胞株有支原体污染时,该如何处理?
直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。
支原体之检测:
***********直接培养法*************
·
原理:
直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成。
特点:
是目前最直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
缺点:
培养时间长,须3-5星期才能判断。
有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis)。
需同时培养支原体株作为正反应对照组,可能会造成污染。
材枓:
dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth(Difco0554-17-1)horseserum、15%yeastextractsolution(autoclaved)、Bactoagar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次打开厌氧缸后,用70%ethanol擦拭内壁。
)
培养基制备:
基本配方为DifcoPPLObroth(60%),马血清(20%),15%yeastextreatsolution(10%),10xstocksolution(10%)。
由于培养时间长,可加入penicillin(50u/ml)至10xstocksolution或加入thalliumacetate(1:
2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
10xstocksolution(1liter):
称取50gdextrose,10gL-arginineHCl,溶于1liter蒸馏水中。
以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。
分装100ml至瓶中,保存于-70℃。
液体培养基(1liter):
称取21g之DifcoPPLObroth,0.02gphenolred于600ml蒸馏水中,加热搅拌溶解之。
灭菌121℃,15分钟。
待温度降低至室温后,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15%yeastextractsolution,及100ml解涷之10xstocksolution,混合均匀后,分装至已灭菌之有盖螺旋试管中,10ml/管。
保存于4℃,期限1个月。
固体培养基(1liter):
称取21g之DifcoPPLObroth,0.02gphenolred,15gBactoagar于600ml蒸馏水中,加热溶解之。
放在50℃水中浴中,待温度降低至50℃时,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15%yeastextractsolution及100ml解冻之10xstocksolution,混合均匀后,倒入60x50㎜之无菌培养皿中,5ml/培养皿。
步骤:
取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,接种于液体培养基中,置于37℃培养二周,观察是否有混浊或是pH值改变之情形。
培养一周及二周后,分别取0.1ml液体培养液涂在agarplate上,将其倒放置于37℃厌氧箱培养,培养至少3星期,持续观察是否有支原体之菌落出现。
另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,涂抹在agarplate上,37℃厌氧培养3星期,持续观察是否支原体菌落出现。
另作正负反应对照组,正反应对照组为Acholeplasmalaidlawii(ATCC23206)与M.arginini(ATCC23838)。
负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
结果判读:
支原体生长较慢,所以先在液体培养基培养1~2周增殖后,再培养于agarplate上。
需至少培养3星期后,才可断定是否有支原体污染。
所以整个测试需5个星期才知正确结果。
典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried-egglike),乃是由于支原体往agar下层生长所致,为圆形无色透明菌落,大小约10-55μm。
但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落,有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态(slime)。
若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自agarplate上切下,重新培养于液体培养基中,培养一星期后再种入agarplate,若是细胞则不会生长。
DNA萤光染色法
原理︰利用萤光染剂(bisbenzimide,Hoechst33258)侦测支原体污染。
此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T)rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。
被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。
测试步骤用间接步骤,将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中(indicatorcell,例如Verocellor3T6cell),然后培养指示细胞再作萤光染色。
正负反应对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照。
待测细胞亦可作直接测试,但需为吸附型细胞,培养后直接作萤光染色。
有些细胞易有萤光背景,而干扰结果判读,则建议使用接种于指示细胞之步骤。
特点︰简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行之侦测步骤。
可以侦测不易培养之支原体,例如M.hyorhinis,较直接培养法快,约一星期即可知道结果。
有时仍会有萤光背景,影响判读。
材料︰
Hanks’balancedsaltsolutionwithoutNaHCO3orphenolred(HBSS,GibcoBRL21250-014﹚、bisbenzimide(HoechstNo.33258,SigmaB-2883)、thimerosol(SigmaT-5125)、0.1Mcitricacid、02Mdisodiumphosphate、glycerol、glacialaceticacid、methanol、strerileH2O、chamberslide(Nunc177380)或chamberslide替代物:
35or60mmsterileplate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内,使用前过火灭菌﹚,一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。
染色后取出盖玻片,细胞面朝下放在玻片上观察。
Indicatorcells:
Vero(Africangreenmonkeykidney,ATCCCCL-81orCCRC60013)or3T6(mousefibroblast,ATCCCCL-96orCCRC60070),细胞须先测试无污染。
αMEMwith10%FBS(mediumforVerocell)
配制试剂:
无菌HBSS︰配制Hanks’balancedsaltsolution,以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。
勿用高压蒸汽灭菌。
Hoechst33258stocksolution(100X)︰称取5.0mgbisbenzimide和10.0mgthimersol溶于100ml无菌HBSS,置于棕色瓶中,室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后,以1ml分装至1.5ml小离心管中,贮存于-20℃。
Hoechst33258workingreagent︰取1mlHoechst33258stocksolution,加入sterile100mlHBSS中,室温下搅拌45分钟,置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆,避免光照,贮存于4℃。
mountingsolution︰22.2ml0.1Mcitricacid和27.8ml0.2MNa2HPO4加入于50mlglycerol中混合,以1NNaOH调整pH至5.5(pH很重要),贮存于4℃。
固定溶液(fixative)︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合,使用前才配制。
培养Vero细胞:
Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管,测试前解冻培养。
测试前一周培养Vero细胞。
在接种测试样品前一日,以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞,制成细胞悬浮液,以1~2x10^4cells/ml培养于chamberslide中,每个well加入1ml细胞悬浮液,于37℃,5%CO2培养。
隔日确定生长良好后,即可接种测试样品。
接种测试样品:
样品种类:
1ml待测之培养基,1ml待测细胞培养液(可将细胞稍微刮下﹚,0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
将测试样品加入chamberslide内,培养5天后,进行Hoechst33258的萤光染色观察。
以AcholeplasmalaidlawiiATCC23206感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚,负反应对照组为Verocell之新鲜培养基(αMEM+10%FBS)。
DNA萤光染色检测︰
取出培养5日之Vero细胞,吸除培养液。
于每个well中加入2ml1:
3混合的冰醋酸/甲醇固定液,静置10min后,吸除固定液。
重复上述之步骤,风干10分钟。
于每个well中,加入1mlHoechst33258workingsolution,室温下静置30min。
吸掉Hoechst33258染液后,以无菌水洗涤3次,风干后加入1滴的mountingsolution,并以盖玻片覆盖之。
以100x-400x萤光显微镜观察。
打开水银光源10min后,以UV激发光束(330~380nm)之滤光镜,观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
结果判读︰
若有支原体污染,在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。
其形状一致,与细胞残片染成之不规则点状物不同。
其萤光可维持数星期。
图例(A)为negativeresult:
萤光显微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染。
(为positiveresult:
在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点,表示测试样品有支原体的污染。
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- 细胞 支原体 污染