霍乱弧菌的分离与鉴定总结.docx
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霍乱弧菌的分离与鉴定总结
霍乱弧菌的分离及鉴定
濮阳市疾病预防控制中心
一、标本的采集和送检:
1.标本的采集:
1)粪便标本:
应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集;
2)采便方法:
可用棉拭采取自然排出的新鲜大便,亦可用直肠棉拭采便管由肛门插入直肠内3~5厘米处采取。
3)采样要求:
☞水样便采取1~2毫升,成形便采取指甲大小的粪量.病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。
☞外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。
☞按1:
10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中,迅速送往实验室。
4)肛拭采集的注意事项:
1.棉拭子要用竹签,圆形、光滑以免采样时易断;
2。
棉拭子做的要稍大而紧固(避免采集时脱落);
3。
采集者应穿戴一次性手套;
4。
采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水(APW)蘸湿,多余的液体紧靠管壁挤出;
5。
采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下,劝其用单手或双手协助分开股沟(或采集者用左手分开股沟),右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4~5cm(幼儿约2~3cm)处,转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出;
6。
棉拭子在推进时如感觉遇到阻力,应调整角度后缓缓旋转推进,避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出;棉拭子进入的深度一定要够,否则采集的有效标本量会很少;
7。
采集的标本拭子应立即置入APW内,手接触的部分在管口折断弃去。
填写采样登记表(单),并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄,尽快送检。
二、快速诊断:
1。
直接镜检:
为争取最快速度作出诊断,采取病人“米泔水样”大便或呕吐物,悬滴法镜检(最好用暗视野),可见具有流星状动力的细菌。
2.特异性制动试验:
☞取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴,置于载玻片上,再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清,加盖玻片,用暗视野显微镜观察,3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性,此法优点是快速而特异,操作简便,可
☞在几分钟之内做出初步诊断。
但要求标本必须有较多数量的弧菌,免疫血清最好是不加防腐剂的.
3.早期玻片凝集试验:
☞埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快,37℃培养8~10小时,在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落的情况下,埃尔托型菌落直径可达1~2mm。
将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出,直接用霍乱多价血清做玻片凝集,阳性者可做初步报告。
琼脂平皿继续培养,接常规培养时间再作一次复查。
4.霍乱弧菌胶体金免疫层析快速检测:
(1)原理:
采用胶体金免疫层析双抗体夹心法,检测标本中霍乱弧菌。
以胶体金作为标记物,交联抗霍乱弧菌(O1群/O139群或O1群E1Tor型小川血清型、稻叶血清型)单克隆抗体,及样品中的霍乱弧菌(O1群/O139群)结合.形成双抗体夹心一步法,呈现出目测可见的红色条带,显色程度及抗原含量成正比。
(2)特点:
☞灵敏度高、特异性强,操作简便、快速,省力省时;
☞对于典型霍乱病人水样或米泔样便结果准确、易于判读;
☞但对于含霍乱弧菌少的粪便标本易出现假阴性;
☞对脓血便标本易出现假阳性。
3)操作步骤:
☞将检测卡放置及洁净、干燥的工作台上;
☞实验前,请将试剂恢复至室温;
☞用吸管取病人水样便样品2~3滴,加入检测
卡一端的加样孔,计时并观察反应结果;
☞2-15分钟内观察结果,20分钟之后结果不能
判读 。
(1)滤样纸(加样区);
(2)玻璃纤维膜,膜上吸附着干燥的金标抗原;
(3) 硝酸纤维素膜,膜上包被的抗原和抗体呈线状; ﻫ(4)吸水纸。
三、直接分离、培养:
☞急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时可用选择性培养基直接划线分离。
目前常用的强选择性培养基有TCBS琼脂、4号琼脂和庆大霉素琼
脂等。
☞置37℃10~14h孵育培养。
四、APW增菌、分离:
☞所有粪便标本都应经过增菌,尤其是恢复期病人,带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少,单靠直接分离不易检出,需经碱胨水37℃增菌6~8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内);
☞标本含菌量少时,为提高检出率可实行2次增菌,取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1~0.2毫升,接种于8~10毫升的碱胨水中,37℃培养6~8小时后再做分离;
☞霍乱弧菌好氧,易形成的菌膜,故在取出增菌管时动作要轻,接种环于菌膜下取一满环,划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
五、血清学凝集试验:
1.玻片凝集试验:
☞自分离培养基上挑取可疑菌落及O1群霍乱多价诊断血清、O139群霍乱诊断血清以及稻叶、小川型诊断血清做玻片凝集试验;
☞同时注意做盐水凝集对照试验.
2.要求及注意事项:
☞有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌,可疑菌落较多时,应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查;
☞必要时,取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集(对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意)。
☞平皿分离未获分散的单个菌落,而在密集部位仍有可疑菌落时,应将该部分再做分离或经增菌后再做分离;
☞从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌,这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集,以确定是否为粗糙型或NAG弧菌;
☞注意当霍乱弧菌在4号及庆大霉素培养基上生长过久(超过36小时)时,会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象;
☞故应取新鲜培养物(10~14h)作凝集试验,凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。
☞小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集,这并非彦岛型,而是小川型含有少量C抗原成分的缘故;
☞首例病人应以两个单价血清的试管凝集试验确定。
六、初步鉴定试验:
1.氧化酶试验:
在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴,并使其流开.或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上,在1分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色(有的最后呈黑紫色)为氧化酶阳性。
(肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性)。
氧化酶试验注意事项:
试验时避开含铁物质(如接种环)。
不能直接取产酸培养基上的菌落,不能取含还原剂的培基及含亚碲酸盐培基上的菌落(亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶),以免出现假阳性和假阴性.
2。
拉丝试验:
在玻片上加一滴试剂,取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀,再及试剂混合制成浓厚悬液。
阳性者很快(30S内)由混变清并变得很粘稠,用接种环挑取时,可以拉出细丝来.
阴性者呈均匀悬液状态,及蒸馏水对照相同。
(古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。
)
弧菌科菌属氧化酶试验、拉丝试验鉴别表
弧菌科
氧化酶试验
拉丝试验
弧菌属
(目前发现具
致病性弧菌)
O1群霍乱弧菌
+
+
O139霍乱弧菌
+
+
NAG弧菌
+
+
河弧菌
+
+
霍利斯弧菌
+
+
少女鱼弧菌
+
+ (80%)
弗尼斯弧菌
+
+
副溶血弧菌
+
+(64%)
溶藻弧菌
+
+ (91%)
拟态弧菌
+
+
麦氏弧菌
-
+
创伤弧菌
+
+
辛辛那提弧菌
+
+
气单胞菌属
气单胞菌
+
-(90%)
邻单胞菌属
类志贺邻单胞菌
+
-
3.O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验:
☞用接种环或灭菌棉拭子在含0.5%氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌,放上10µg、150µgO/129磷酸盐药敏纸片各一片,37℃培养过夜。
凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。
☞古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感;
☞O139群霍乱弧菌10µg、150µg均不敏感。
七、初步结果报告:
B霍乱弧菌以血清学鉴定为主,结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出
判定。
凡具备弧菌菌落特征、及O1群或O139群多价血清凝集,O1群并可用单价血清分型即可判定.
:
首例病人应辅以氧化酶、拉丝试验、O/129敏感试验。
基层CDC至此即可上报.
8上报国家需做生化、噬菌体—生物分型试验。
+报告名称--“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌"。
八、 生化鉴定试验:
试验项目
O1群
O139群
NAG
试验项目
O1群
O139群
NAG
氧化酶
+
+
+
甘露糖
+
+
+/-
粘丝
+
+
+
阿拉伯糖
—
-
—
O/129敏感(10µg)
+
+
-
肌醇
—
-
-
O/129敏感(150µg)
+
+
-
赖氨酸脱羧酶
+
+
+
动力
+
+
+
鸟氨酸脱羧酶
+
+
+
靛基质
+
+
+
精氨酸双解酶
—
-
—
V—P
+/-
+
+/—
0%盐胨水
+
+
+
甲基红
+
—
-/+
3%盐胨水
+
+
+
硝酸盐还原
+
+
+
6%盐胨水
+/-
+/-
+/—
葡萄糖产酸
+
+
+
8%盐胨水
—
—
-
葡萄糖产气
—
-
-
10%盐胨水
-
-
—
蔗糖
+
+
+/-
山梨醇
-
—
+
九、噬菌体-生物分型:
1.古典型和Eltor分型:
☞目前仍依靠第IV组霍乱噬菌体常规稀释液(106/毫升)裂解试验、多粘菌素B敏感试验、鸡血球凝集、V-P和溶血试验进行两种生物型的鉴别仅作参考.
☞埃尔托型已出现大量非溶血菌株,因此溶血试验已不能作为区别两个生物型的主要方法.
O1群霍乱弧菌古典型和El-Tor生物型的鉴别
鉴 别 试验
O1群霍乱弧菌生物型
古典型
埃尔托型
1.第IV组VC噬菌体(106/ml)
+
-(+)
2.多粘菌素B敏感
+
-(+)
3。
鸡血球凝集
-(+)
+(—)
4.V—P
-
+(-)
5.溶血
—
+/-
注:
括弧内为少数菌株结果。
鉴 别试验
O1群霍乱弧菌生物型
古典型
埃尔托型
1.第IV组VC噬菌体(106/ml)
+
-(+)
2.多粘菌素B敏感
+
—(+)
3。
鸡血球凝集
-(+)
+(-)
4。
V-P
—
+(-)
5。
溶血
—
+/-
注:
括弧内为少数菌株结果。
(1)噬菌体分型:
☞根据五株国内分离的5种弧菌噬菌体 (VP1~VP5)将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型(见下表)。
方法:
利用双层琼脂平皿法进行噬菌体滴皿裂解试验。
噬菌体型
对分型噬菌体的敏感性
噬菌体型
对分型噬菌体的敏感性
VP1
VP2
VP3
VP4
VP5
VP1
VP2
VP3
VP4
VP5
1
+
+
+
+
+
17
-
-
-
+
+
2
+
+
+
-
+
18
-
-
+
—
+
3
+
+
-
+
+
19
-
+
-
-
+
4
+
-
+
+
+
20
+
-
—
—
+
5
-
+
+
+
+
21
-
-
+
+
-
6
+
+
+
+
-
22
—
+
—
+
—
7
—
+
+
-
+
23
+
-
—
+
-
8
-
-
+
+
+
24
-
+
+
—
-
9
-
+
—
+
+
25
+
-
+
-
-
10
+
—
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