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流动相

总称

固定相

色谱名称

气体

气相色谱

固体

气-固色谱gas-solidchromatography，GSC

液体

气-液色谱gas-liquidchromatography，GLC

液相色谱

液-固色谱liquid-solidchromatography，LSC

液-液色谱liquid-liquidchromatography，LLC

超临界流体

超临界色谱

超临界色谱supercriticalfluidchromatography，SFC

1.2.2按分离过程的物理化学原理分类

按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，可将其分为如下几类。

（1）分配色谱（partitionchromatography）利用各个被分离组分在固定相和流动相两相之间分配系数的不同而进行的分离称为分配色谱。

也可以说，分配色谱主要是根据物质在两相中的溶解度差异而实现分离。

分配系数KD是固定相中一种组分的平衡浓度对流动相中同一物质的浓度之比，所以，各组分的分离效率与其分配系数的差值成正比。

在分配色谱法中，通常使用两相系统。

用液体作固定相，利用试样组分（亦称为溶质）在固定相中溶解、吸收或吸着（sorption）能力差异，在两相间分配系数不同从而将组分分离，如气-液分配色谱、液-液分配色谱。

在液-液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极性不同，又分为正相分配色谱和反相分配色谱。

一般来说，以强极性、亲水性溶剂或水溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称为正相分配色谱（normalphasepartitionchromatography），简称正向色谱（NPC）。

若以非极性、亲脂性物质为固定相，极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，则称为反相分配色谱（reversedphasepartitionchromatography），简称反相色谱（RPC）。

正相色谱和反相色谱的概念，现已推广应用到其他类型的液相色谱。

如果将一种非挥发性液体固定在适当的固体载体上，那么分配色谱法也可以在气相和非挥发性液相之间进行。

液相中被分离组分溶解度的差异两次得到利用，溶解度较小或挥发的组分在一定温度下由载气迅速带走，从而使各个组分得到分离。

（2）吸附色谱（adsorptionchromatography）由于物质对活性固体（或液体）表面吸附力具有差异，使混合物中不同组分在固体（或液体）界面上呈现出浓度变化，发生某些组分的浓缩，这种现象称为吸附。

对于各组分来说，吸附系数的差异决定于相界面上浓度的差异。

若两相之间做相对移动，则这种差异就表现为色谱分离。

所以，吸附色谱是以固体或液体吸附剂作固定相的气相色谱或液相色谱，它利用组分在吸附剂上吸附力的不同，因吸附平衡常数不同而将组分分离。

吸附的亲和力主要取决于物质的极性大小等因素。

有机化合物分子中的官能团与非极性的碳链相比，对吸附色谱的分离效果有更大的影响。

吸附色谱适宜于把混合物中的物质按其所含的极性基的数目和类型进行分类。

（3）离子交换色谱（ion-exchangechromatography）如果被分离的各组分在溶液中形成离子，那么这些离子就与溶液中离子交换剂的解离基团发生静电作用，这种静电的相互作用就是离子交换。

液相色谱中利用这种离子交换原理而进行分离的色谱，称为离子交换色谱。

这是用离子交换剂为固定相，分离离子型化合物的色谱方法。

通常，带电荷多的离子对交换剂的亲和力大于带电荷少的离子。

被分离混合物中各组分的离子交换能力，将取决于各组分电荷的差异。

解离组分的平均电荷与离子电荷、基团的解离常数以及介质的pH值有关，同时还取决于溶液中的离子浓度。

在离子交换色谱中固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，带有固定正电荷的称为阳离子交换树脂。

固定电荷吸引相反符号的对立离子以保持中性。

（4）凝胶色谱（排阻色谱）（gelchromatography）空间排阻色谱（又称排斥色谱）与其他色谱机理不同，它近似于分子筛效应。

空间排阻色谱的色谱柱内填充以凝胶，凝胶内具有一定大小的孔穴。

样品进入色谱柱后，随流动相在外部间隙以及凝胶孔穴旁流过。

体积大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而排阻，因此较早的被冲洗出来；

中等体积的分子产生部分渗透作用；

小分子可渗透到孔穴里去，因有一个平衡过程而较晚地被冲洗出来。

这样，样品分子基本上是按其分子大小排阻先后由柱中流出，从而达到分离。

对同系物来说，洗脱体积是分子量的函数。

洗脱次序将取决于分子量大小。

分子量大的先流出色谱柱，分子小的后流出。

空间排阻色谱法也叫凝胶渗透法或凝胶过滤法。

这种方法在50年前便开始应用，当葡聚糖凝胶出现以后，由于可以测量较广范围内分子量的分布，因此受到很大重视。

最初，流动相主要使用水溶液，所以采用凝胶过滤这一名词。

后来可以用非水溶剂，亦称用凝胶渗透过滤。

两者的分离机理没有任何区别。

确切地说，应该将此法称做空间排阻色谱，或称排斥色谱。

（5）亲和色谱（affinitychromatography）前几种色谱的原理是建立在被分离物质对固定相“亲和力”的差异上，而亲和色谱中的“亲和力”是建立在生物化学过程中，被分离物质与具有特异性质的配基相互作用的基础上。

这种特异的相互作用产生在具有高选择性反应的一对物质之间，例如，抗体和抗原彼此特意地结合在一起，酶与其底物起反应，而不与其他物质作用等。

如果上述一对物质中的一种以共价键的方式键合在一种适当的载体上，而又不丧失其功能，那么它就可以从溶液中选择性地结合与其配成对的另一物质。

如果把这种制剂装入色谱柱中，使溶液以慢速通过，则所需组分被结合而保留在柱中。

柱子再经洗涤解析之后就得到所分离的物质。

亲和色谱中成对物质的结合具有专一性，同时是可逆的。

1.2.3按固定相形状分类

（1）柱色谱（columnchromatography）固定相装在色谱柱内称为柱色谱。

根据色谱柱的尺寸、结构和制备方法不同，又分为填充柱（packedcolumn）色谱和毛细管柱（capillarycolumn）或开管柱（opencolumn）色谱。

GC、HPLC均为柱色谱。

（2）平板色谱（planarchromatography）固定相呈平板状，当流动相流过时，样品组分在平板上展开，进行分离。

平板色谱包括薄层色谱（thinlayerchromatography）和纸色谱。

当固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板或塑料板上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层色谱（TLC）。

用滤纸做固定相或固定相载体的色谱，则称为纸色谱（PC）。

（3）纸色谱（又称纸上层析）是以纸为载体的液相色谱法，属于分配色谱的一种。

它是借助滤纸作为支持物，用水饱和后构成固定相。

当与固定相不相混溶的有机溶剂流动相通过固定相时，使被分离的各个组分连续地在两相之间动态分配，从而达到分离的一种操作。

滤纸本身是惰性的，不参与分离组分的过程，只起负载水分的作用，分离由组分在流动相和纸上水分之间的分配不同所引起。

因此在纸色谱中，组分在两相中的分配系数起主要作用。

化合物在纸色谱上的位置用比移值Rf表示。

Rf=化合物移动距离／展开剂移动距离

Rf值随被分离化合物的结构、固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素而变化。

当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值Rf就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。

由于影响Rf值的因素很多，实验数据往往与文献记载不完全相同，因此在鉴定时常常采用标准样品作对照。

此法一般用于多功能团或高极性化合物如糖、氨基酸等有机物质的微量（5～500mg）定性分析。

1.2.4不同色谱方法的比较

纸色谱、薄层色谱、高效液相色谱以及气相色谱是四类广泛应用的色谱技术，它们各有优缺点及适用范围。

纸色谱是几种色谱中最廉价的一种，但展开时间长，用来分离水溶性物质比较方便。

薄层色谱的优点是设备和操作比较简单，展开时间快，应用范围及分析对象很广。

无论是无机、有机、生化、药物等都可应用薄层色谱；

从化合物的性质来看，小分子或大分子化合物，水溶性或非水溶性物质等各种类型物质的分离、精制、鉴定和定量都可用薄层色谱。

高效液相色谱在定量的精确性和稳定性等方面比薄层色谱更好，但设备和实验费用较高。

气相色谱定量准确性高，但只适用于在设备柱温条件下（一般为200～300℃）能汽化的化合物，因此限制了它的应用范围。

在有机化合物中大约只有20%～30%的产品适用，在实际应用中所占比例偏少，但仍具有液相色谱不可取代的优势。

表1-2就不同色谱在设备、适用对象等方面的差异进行了比较。

表1-2几种色谱方法的比较

项目

纸色谱

薄层色谱

高效液相色谱

设备

简单

较简单

复杂

分析对象

水溶性物质

较广

能汽化的高温稳定物质

样品用量

nμg

0.01～1μg

检测灵敏度/g

10-5

10-7

10-8～10-12

10-10

检测方法

以物质的化学特性或物理特性为基础的显色剂、扫描法

紫外、可见荧光光谱、示差折光、电化学

热导池、氢火焰

定量准确度

＋

＋＋

定量重现性/%（体积分数）

2～5

1

展开及洗脱时间/min

160～480

20～100

5～60

1.3薄层色谱

1.3.1简介及一般原理

薄层色谱法（TLC）通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法，即将吸附剂在光洁的表面，如玻璃、金属或塑料等的表面上均匀地铺成薄层，而后按照与纸色谱相似的操作点上样品，以流动相展开。

这样，组分不断地被吸附剂吸附，又被流动相溶解解吸而向前移动。

由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力，因此在流动相向前流动的过程中，不同组分移动不同距离，以实现分离。

这种分离的机制是吸附力的强弱差别，所以一般的薄层色谱法属于吸附色谱法的范畴。

一种物质在TLC上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称作该化合物的比移值，用Rf表示。

即：

当实验操作条件（如固定相、展开剂等）固定时，Rf是一个化合物的特有常数，故可利用它来鉴别有机化合物或作为监测反应进程的一种手段。

TLC应用于分离提纯的操作，是将展开后的各个色带取下，用溶剂溶解各个色带的物质从而获得纯度高的产品，此时称之为制备薄层色谱。

此外TLC也经常用于寻找柱色谱的最佳分离条件。

薄层色谱常用的固定相有硅胶或氧化铝。

硅胶具有不同的型号，如硅胶H（不含粘合剂）、硅胶G（含煅石膏粘合剂）、硅胶GF254（既含燃石膏又含荧光剂）等类型。

氧化铝也具有上述型号，且有中性、酸性、碱性之分，分别用于分离中性、酸性和碱性物质。

用不含有粘合剂的硅胶制成的板叫软板，用含有粘合剂的硅肢制成的板叫硬板。

实用中即使使用硅胶G，也要再加入羧甲基纤维素钠或淀粉粘合剂，以增强板的硬度。

硅胶、氧化铝吸附剂是极性化合物，它和化合物分子之间的作用力主要是范德华力和氢键，所以当展开剂的极性远远大于混合物中各组分的极性时，它将代替混合物中各个组分而被吸附，这样各组分只能保留在流动相中，此时Rf=1，达不到分离目的。

相反，当展开剂极性远远低于混合物各组分极性时，Rf=1，也达不到分离的目的。

所以在实际科研工作中，展开剂的选择是重要的一环。

选择一个展开剂往往要经过多次实验进行对比，有时单一溶剂不行，可以采用不同比例的多组分混合溶剂。

为达到某些分离的目的，薄层色谱法有时也利用其它分离机制，如分配、离子交换、分子排阻等方法，这主要取决于所用的固定相。

在进行分配分离时，要在铺好的薄层上均匀地再涂布一种做为固定泣的液体，此时铺层的材料最好不用吸附剂而改为惰性物质，如纤维索、酸藻土等，以免发生不必要的吸附作用而干扰分离。

将铺层的材料改为离子交换剂或凝胶，即可进行离子交换薄层色谱或分子排阻色谱的分离，分别适用于离子化合物与大分子物质的分离。

1.3.2实验装置与仪器

薄层色谱所使用的仪器是铺有硅胶或氧化铝固定相的玻璃板放在一个相应的展开器中构成，如图1-2。

加盖的广口瓶也可用做展开槽。

通常作定性分析所使用的玻璃板为7.5cmx2.5cm或相近规格，而作为分离提纯使用的制备薄层色谱的玻璃板则根据实际情况确定，比如20cmx30cm。

固定相或载体最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。

其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。

薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;

前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏（CaSO4.2H2O在140℃烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5～0.7％）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。

图4-2薄层层析示意图

1.3.3薄层色谱法基本操作

薄层色谱法与纸色谱法的基本操作相同，都包括点样、展开、显点定位等步骤，现分别概述如下。

（1）薄层板的准备将吸附剂均匀地涂铺在大小适宜的平板玻璃或其它光洁表面上，待干燥活化后使用。

现在有各种规格的预制板出售，买来即可应用，可省去制板步骤。

（2）点样在薄层板的一端约1～3cm处点上样品溶液，待溶剂挥发后即可将薄层板放入槽内展开。

（3）展开展开为使流动相溶剂沿滤纸或薄层板从点有样品的—端向另一端流动的过程。

在此过程中，样品中组分被流动相带动前移，并由于与固定相的亲和力不同而得分离。

一般进行薄层色谱时，通常可以立即以流动相展开，即使需用蒸气饱和时，一股时间也较短，展开时间较快。

（4）定位经上述展开至溶剂前沿到达薄层板的另—端时，即可将薄层板取出，待溶剂挥干后用适宜方法确定组分斑点的位置，如观查荧光，喷以试剂使斑点显色等。

由于一般薄层板材料多为无机物，所以可以使用各种显色试剂，包活腐蚀性较强的物质如浓硫酸等。

纸色谱和薄层色谱法的优点之一是可以用多种方法显示斑点位置。

（5）定量确定斑点位置之后，即可对其进行定量测定。

可以将有斑点的薄层上吸附剂取下，用适当溶剂将该组分溶出洗下，再以适宜方法测定。

近年来由于光密度计仪器的发展，已较广泛地用于纸色谱与薄层色谱斑点的定量测定。

斑点不必洗脱，直接在光密度计上测量斑点的吸光值或荧光，并与标准品同样处理的结果进行比较，这样可以较快速、较准确地测定。

综上所述，纸色谱法和薄层色谱法的操作大体相同。

相比之下，薄层分离所需时间较短，分离能力较强，斑点较集中，因此检出灵敏度较高。

纸色谱分离后的斑点较为扩散，检出灵敏度不如薄层，展开时间较长也是它的一个缺点。

但有些水浴性成分如糖、苷、氨基酸等用纸色谱法比用薄层法的分离效果好些。

二者共有的优点是不需特殊设备，操作简便，可分析微克量的样品。

1.3.4纸色谱及薄层色谱实验注意事项

（1）制板薄层色谱分析时，制好的玻璃板应放于水平台上并注意防尘。

使用前将其放于紫外光灯（254nm）下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。

（2）点样用微量进样器进行点样。

点样前，先用铅笔在层析上距末端lcm处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，若要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。

一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm。

底线距基线1～2.5cm，点间距离为lcm左右，样点与玻璃边缘距离至少lcm，为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1～2cm，再进行点样。

（3）展开

①展开室应预饱和。

为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂；

或者在壁上贴两条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖。

②展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。

③点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。

④展开室应密闭，展距一般为8～15cm。

薄层板放入展开室时，展开剂不能没过样点。

一般情况下，展开剂浸入薄层下端的高度不宜超过0.5cm。

⑤展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。

⑥展开后的平板用适当的方法，使溶剂挥发完全，然后进行检视。

⑦Rf值一般控制在0.3～0.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变流动相的比例。

（4）斑点的检出

展开后的平板经过干燥后，常用紫外光灯照射或用显色剂显色检出斑点。

对于无色组分，在用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量要适度。

紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。

展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值（Rf值）来表示。

化合物斑点中心至原点的距离与溶剂前沿至原点的距离的比值就是该化合物的Rf值。

1.4柱层析的基本装置及基本操作

目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。

1.柱层析的基本装置

2.柱层析的基本操作

柱层析的基本操作包括以下一些步骤：

（1）装柱

柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。

一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。

否则要重新装柱。

首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。

一般柱子的直径与长度比为1:

10～50；

凝胶柱可以选1:

100～200，同时将柱子洗涤干净。

将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N～1N）、碱（0.5N～1N）、盐（0.5M～1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。

然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。

关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。

打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。

（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。

）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。

最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2～3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。

（2）平衡

柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。

用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。

平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。

如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。

有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。

这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。

（3）加样

加样量的多少直接影响分离的效果。

一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。

通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。

当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。

应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。

详细操作见层析实验。

（4）洗脱

当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。

简单洗脱：

柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。

如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。

但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。

否则应采用下面的方法。

分步洗脱：

这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。

它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。

每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。

梯度洗脱：

当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。

它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。

最常用的是浓度梯度。

在水溶液中，亦即离子强度梯度。

可形成梯度的形式有三种。

洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。

当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。

同时还应注意洗脱时的速率。

前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。

事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。

速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。

只有多次试验才会得到合适的流速。

总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。

还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。

（5）收集、鉴定及保存

在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。

由于检测系