RTPCR实验报告课件文档格式.docx

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（q-pcr）的一种，以一准时间内dna的增幅量

的定量使用萤光色素，当前有二种方法。

一种是在

dsdna

中插入特异的萤光色素；

另一种使用一种能与增幅

序列中特定寡核酸序

列相联合的一种萤光探针（

probe

）。

real

time

与

reverse

transcription

相

联合，能用微量的

来找出特准时间、

细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种

rt

的组合又被称之为“定量

（

quantitativert-pcr

）”

技术有关试剂

oligo:

多聚体，相当于

mrna

引物

amv

dntp

rnase

（m-mlv）：

逆转录酶

：

脱氧核苷酸

rna酶克制剂

pcrbuffer

rt-pcr

缓冲液

mgcl2

2价镁离子

各步骤的目的

（一）预变性：

损坏

中可能存在的较难损坏的二级构造。

使

充分变性，减少

复杂构造对

扩增的影响，以利于引物更好的和模板联合，特别是对于基因组根源的

模板，最好不要

吝

啬这个步骤。

别的，在一些使用热启动taq酶的反响中，还可激活taq酶，进而使pcr

反响得以顺利进行。

（二）变性--退火--延长循环：

①模板dna的变性：

模板dna经加热至93℃左右一准时间后，使模板dna双链或经pcr

扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物联合，为下轮反响作准备；

②模板dna与引物的退火（复性）：

模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，

引物与模板dna单链的互补序列配对联合；

③引物的延长：

dna模板--引物联合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反响原料，

靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保存复

制链。

（三）pcr仪扩增循环后72度延长10分钟

用pcr仪扩增时,（变性.退火,延长）循环达成后,持续72度延长了10分钟的原由：

1.

延长时间取决于待扩增

dna片段的长度。

（自然是在反响系统必定的条件下）

比如，使

用taqdna聚合酶，72度时的碱基掺入率为

35-100bp/s

，所以延长速率为

1kb/min

2.

依据延长速率推得，扩增

1kb之内的

dna片段

1min即可，而3-4kb

则需要

3-4min，

挨次照推。

往常在最后一轮要适合的将

延长时间延长至4-10min，这样做是使pcr反响完好以提升扩增产量。

3.持续72度延长了10分钟除了能够使pcr反响完好以提升扩增产量外，还有一个作用

是：

在用一般taq酶进行pcr扩增时在产物尾端加a尾的作用，能够直接用于ta克隆的进行。

什么是半定量pcr

半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitativereversetranscriptionand

polymerasechainreaction,sqrt-pcr）是最近几年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方

法，经过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数目，能够推断样品中

特异

的相对数目。

以半定量

为基础成立起来的

含量测定技术，

较含内标化

定量测定的

的方法更为简易可行。

这类方法不另设‘内标准

清除了俩对不

同引物之间的相互克制和敏捷读差别，并且拥有显然的剂量－效益关系和优秀的重复性。

步

骤：

1.抽提rna，2.反转录获取cdna，3.以cdna为模板做pcr注意：

步骤1，

rna抽提质量必定要好，注意污染。

内参的选择，常用的有βactin和gapdh俩中。

步骤

3，半定量

应当再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时

候能够放在一各泳道里跑！

指数期和平台期必定要摸清楚！

半定量rt-pcr与荧光定量real-timepcr最大的差别就在于semi-pcr需要跑电泳根

据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或许是表达量的高低而real-timepcr则无需

电泳能够及时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standardcurve来判断gene拷贝

数的高低。

所以由上可见semi-pcr不如real-timepcr精准。

至于rt应当指reversetranscription。

为了便于划分我们更偏好使用qpcr来特指real-timepcr

同时要注意realtime-pcr的定性问题，有时你扩增出来的很有可能不过引物二聚体。

所以要利用meltingcurve，假如是第一次做一个目的基因的realtime-pcr，仍是要在2%的

琼脂糖凝胶中进行电泳，以确立与你要扩增的目的基因大小一致。

rt-pcr只好经过模板pcr后扩增的结果间接的反响初始模板的量。

而realtime-pcr的

结果直接能够看到初始模板的量。

所以，

realitime-pcr

更精准些。

篇二：

实验方法

逆转录pcr（rt-pcr）

实验四逆转录

（rt-pcr）

【实验目的】

1．认识用逆转录

法获取目的基因的原理。

2．学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。

【实验原理】聚合酶链式反响（pcr）过程利用模板

变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增dna序列。

因为上一轮的扩增产物又作为下一

轮扩增的模板，是一个指数增

实验四

pcr（rt-pcr）

1．认识用逆转录

2．学习和掌握逆转录

pcr的技术和方法。

【实验原理】

rt-pcr技术敏捷并且用途宽泛，

病毒的含量和直接克隆特定基因的

可用于检测细胞中基因表达水平、

cdna序列。

rt-pcr比其余包含

表达差别，细胞中

northern印迹、rnase

保

护剖析、原位杂交及

s1

核酸酶剖析在内的

剖析技术，更敏捷，更易于操作。

的基根源理（图

4.1）。

第一是在逆转录酶的作用下从

合成

cdna

，即总

中的

在体外被反向转录合成

拷贝，因拷贝

的核苷酸序列完好互补于模板

，

称之为互补

dna（

）；

而后再利用

聚合酶，以

第一链为模板，以四种脱氧核苷

三磷酸（

）为资料，在引物的指引下复制出大批的

或目的片段。

时，有

3

种引物可选择

（表

4.1）

用

1）和

2）方法，

先

理论上是扩增的所有的

，还要用此产物做

要

的模板持续扩增。

假如用

3）方法，

去

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pn=2&

x=0&

y=1268&

raww=535&

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0_0_135_265_601_383_892.979_1262.879&

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_blank"

>

由图4.1

点此查察

不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。

引物在整个转录本的多个

位点退火，产生短的，部分长度的

cdna。

这类方法常常用于获取

5尾端序列及从带有二级结

构地区或带有逆转录酶不可以复制的停止位点的

模板获取

为了获取最长的

cdna，需

要按经验确立每个

每20μl反响系统。

rna样品中引物与rna因为使用随机引物从总

的比率。

随机引物的开端浓度范围为

rna合成的cdna主假如核糖体

50到250ng

，所以模板一

般采纳

poly（a）+rna

oligo（dt）

尾杂交。

因为

开端比随机引物特异性高。

它同大多半真核细胞mrna3端所发现的

poly（a）+rna大体占总rna的1%到2％，所以与使用随机引物对比，

poly（a）

cdna的数

量和复杂度要少得多。

因为其较高的特异性，

一般不需要对

和引物的比率及

poly（a）+选择进行优化。

建议每

合用于多半rt-pcr。

20μl

反响系统使用

0.5μgoligo（dt）

oligo（dt）12-18

基因特异性引物（

gsp）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。

gsp

是反义寡聚核苷，可

以特异性地同

目的序列杂交，而不象随机引物或

那样同所有

退火。

用于

设计

引物的规则相同合用于逆转录反响

的设计。

能够同与

mrna3

最尾端退火的

扩增引物序列相同，或

能够设计为与反向扩增引物的下游退火。

已经制备好的双链

和一般

相同，能够插入到质粒或噬菌体中，

为此，第一必需

有适合的接头

（linker）

，接头能够是在

引物上增添限制性内切酶辨别位点片段，经

扩增后再克隆入相应的载体；

也能够利用尾端转移酶在载体和双链

的尾端接上一段

寡聚

dg

和

dc

或

dt

da

尾巴,

退火后形成重组质粒

并转变到宿主菌中进行扩增。

本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因，fas配体（fasl）是一分子量约为40u

的ii型跨膜糖蛋白，属tnf家族成员。

活化的t细胞可表达fas和fasl，并经过fas/fasl

系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。

最近几年研究发此刻部分癌细胞中fasl

表达加强，并与肿瘤的复发转移有关。

我们采纳rt-pcr方法克隆fasl全长cdna并建立其表

达载体，能够为进一步研究fasl的功能供给条件。

在上下游引物的5’端分别加上了限制酶

切位点及其保护碱基（即hindiii和bamhi），以便能够经过双酶切将目的片段定向的克隆

到原核表达载体pgfpuv上（附录图4.3）。

为了便于后续实验能够用金属螯和层析的方法分别和纯化目的蛋白，我们改造了pgfpuv

在其上加了6×

his标签。

【试剂与器材】

（一）试剂

1.总rna（或mrna）

2.rna

酶克制蛋白（

rnaseinhibitor

）：

40u/ml

3.dntp

混淆物

各

10mm）

4.oligo（dt）12-18

2.5?

mol/l

5.10*逆转录合成缓冲液（10?

rtbuffer）：

250mmol/ltris-hcl（ph8.3），375mmol/l

kcl，15mmol/lmgcl2

6.amv

5u/?

l

7.基因特异性

5’和

3’引物各

20?

8.tapdna

聚合酶

9.10*pcr

缓冲液：

500mmol/l

kcl

，100mmol/l

tris?

cl

，在

25℃下，ph9.0

，1.0%triton

x-100

，15mmol/lmgcl2

（二）器材

1）pcr仪，

2）pcr管，

3）微量移液器【操作方法】

（一）逆转录：

1）成立rt反响系统：

2）涡旋混匀，42℃反响1小时，95℃加热5分钟，而后置于冰上。

（二）pcr扩增：

1）成立pcr反响系统：

2）将上述反响系统涡旋混匀,按以下程序运转循环：

step2-4运转30个循环，此中复性温度主要依照引物的不同而不同。

（三）取10-20ulpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的

产物-20

℃保存。

【注意事项与提示】

1.逆转录反响过程，需成立无rnaase

2.成功的逆转录反响决定于高质量的模板

逆转录酶的克制剂，如edta或sds。

别的，

基因组dna。

使用较好的rna分别方法，如

环境，以防止rna的降解。

rna。

高质量的rna起码应保证全长并且不含

rt-pcr所碰到的一个潜伏的困难是rna中沾染的

trizolreagent，会减少rna制备物中沾染篇三：

实验方法总结

实验有三步：

抽提

rna，rt

，pcr

要求：

1.做rt前必需测rna浓度，逆转录系统对rna量仍是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.rt按要求做，一般不会出太大问题。

3.pcr，按惯例。

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完好的cdna存在，不

是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）rt和pcr时的引物设计能否是必定要先知道目的基因的序列？

一定

在rt时，引物设计有3种方法即a：

random9mers；

b：

oligodt-adaptorprimer；

c：

特异的下游引物。

假如用a和b方法，是扩增的所有的cdna（理论上），还要用此产物做

如果用c

方法，那

么

要去那

里

查它

的序

列呢？

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pn=5&

y=474&

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点此查察

?

pcr试剂pcr比较特异性

试剂盒

克隆试剂盒

检测/

去除

rt-pcr试剂rt-pcr标准品定量pcr试剂定量

产物纯化核酸酶聚合酶反转录酶rt-pcr实验方法大全

公布日期:

2007-7-10热点指数:

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rt-pcr实验有三步：

抽提rna，rt，pcr。

标记

总

分别纯化盒

是单改变mg2浓度、退火温度能解决的。

pcr的模板持续扩增。

问题：

在做rt-pcr碰到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中

能够扩出我的目的基因，条带特别的好，而另一组织在相同的条件下却获取很多非特异性的

条带，试试其余条件相同没法获取满意的结果，百思不得其解！

（注：

已必定该基因在两种组

织中都表达，篇四：

rt-pcr实验方法总结大全

rt-pcr实验方法总结大全

1.做rt前必需测rna浓度，逆转录系统对rna量仍是有一些要求，常用

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完好的

500ng或1ug。

cdna存在，不

时，引物设计有

3种方法即

a：

random9mers

；

oligodt-adaptorprimer

a和

b方法，是扩增的所有的

（理论上），还要用此产物做

在做

碰到一怪现象，

即对同一动物不同组织扩增同一段基因，

结果从一种组织中

织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）

从这两种组织中提取的rna的量是不相同的，我测过吸光度，差别还很大，会不会和这

有关呢？

请能手赐教！

解答：

1.rt-pcr有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；

若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。

但以后发