第一章遗传毒理学概述Word文档格式.docx
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凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子(envirnmental
agent),称之为诱变剂(mutagen),也有人译为致突变原、致突变物、诱变原等。
由于这些
物质对生物体的作用点是遗传物质,故也称为遗传毒物(genotoxicagent),突变可以是一
个或几个碱基对的变化(基因突变),也可以是染色体结构(染色体畸变)或数目(非整倍体
和多倍体)改变的大变化,因此对后者也称为断裂剂(clastogen)和非整倍体物(aneugen)。
凡是化学物质和其他环境因子本身能引起突变者,称之为直接诱变剂(directmutagen);
而有些化学物质本身并不能引起突变,必须经体内代谢活化,其代谢产物才具有诱变性,
这类物质称为间接诱变剂(indirectmutagen),或称为前诱变剂(promutagen)。
p2
3.遗传毒性(genotoxicity)和遗传毒理学
已如上述,诱变剂又称为遗传毒物。
从另一角度而言,遗传毒物的生物效应即为遗传
毒性,这种毒性作用是由于化学物和其他环境因子与DNA相互作用,引起生物细胞基因
组分子结构的特异改变,这种有害作用即为遗传毒性。
也可以说,它是诱变性的深入描
述,揭示了这种毒性作用的终点。
遗传毒理学正是研究化学物质和其他环境因子对DNA
损伤的遗传学改变,以及对细胞和机体损害的机制。
所以,人类接触诱变剂,受人关注的
理由:
一是增加了人类生殖细胞的突变率,以引起后代遗传性疾病发生率的增加;
二是体
细胞突变可导致接触个体的各种异常,最显著的是肿瘤。
因此,遗传毒理学发展迅速,备
受毒理学家们关注。
第二节遗传毒理学的研究内容、
任务和方法[1,2,7]
毒理学研究的对象是毒物。
遗传毒理学作为毒理学的一个分支,其研究的对象则是
遗传毒物,即研究人类生产和生活环境中遇到的各种化学、物理和生物等环境因子能导致
生物体遗传物质的损伤或遗传学改变的任何物质或因子。
一、研究内容
遗传毒理学研究内容的特点主要有三方面,即致突变机制、诱变剂的检测和对健康的
危险度评定。
(一)研究致突变机制
遗传毒性作用的发展过程,从机制上讲,首先也有与一般毒性作用发展相一致的过
程,包括4个阶段,第一阶段是从诱变剂接触生物体并到达靶分子的过程,即吸收、分布、
排泄或重吸收、活化和解毒等;
第二阶段是具有活性的化学物与靶分子相互作用的过程;
第三阶段是诱变剂诱发靶分子的功能异常;
第四阶段是分子修复机制的异常,这是一个
导致毒性作用发展的全过程。
而致突变机制,在此基础上,还有诱变剂与DNA相互作用
的机制,从而引起各种类型的基因突变,以及不以DNA为靶而形成遗传毒性的机制。
此
外,还应研究诱发突变后,导致疾病结局的机制,如突变到肿瘤的发生、发展机制。
(二)检测诱变剂
应用各种检测系统检测化学物或其他环境因子是否具有诱变性以及刻画其特征,如
诱变剂系直接诱变剂或间接诱变剂,可诱发基因突变或染色体断裂/整倍体物质。
诱发
的基因突变是碱基对置换或移码突变、诱发染色体结构的改变抑或数目异常,这些都是诱
变剂检测的内容。
为此目的,遗传毒理学家们建立了许多体内、体外试验(称之为测试系
p3
统),这些试验以不同的遗传学终点为观察终点,以不同的生物体或生物细胞为遗传指示
物。
当前,又建立了许多分子终点的新方法,以提供化学物诱发分子损伤的证据,为遗传
毒理学开辟了新的前景。
例如,单细胞凝胶电泳试验(Comet试验)、荧光原位杂交(Fish)
技术、应用转基因动物等,不仅推动了检测诱变剂,并可检测慢性或低剂量接触条件下的
DNA损伤。
(三)评定诱变剂对健康的危险度
危NNNg(riskaSsessment)是对人类检测诱变剂后,潜在遗传毒性作用的量化与特
征化评价过程。
为此,研究的内容包括:
1.化学物质或其他环境因子的定性、定量鉴定
正如所述,应用各种测试系统鉴定人类接触的化学物质和其他环境因子的诱变性,并
观察剂量一效应(反应)关系,以此对照人类接触水平,评价对人的相对危险度。
2.环境中诱变剂的监测
为评定某一诱变剂对人健康的危险度,并予以量化,首先须了解该诱变剂在环境中韵
存在量及其迁移规律,这样才能建立“接触一剂量一反应”间的量化关系,为此,目前开展
了许多利用动、植物的现场监测诱变剂的方法、现场采集样品的方法,以及在进行致突变
试验前对环境样品预处理方法等的研究。
3.生物标志物的研究.
从接触诱变剂到出现各种损害,其中经历一个发展过程。
在这过程中机体出现一系
列的变化,这些变化能尽早被识别,就是依靠识别的标志物(marker),利用人体不同的生
物材料,检查接触遗传毒物(或其代谢物)的数量、遗传毒物引起的生物效应、机体对遗传
毒物反应的能力与水平。
这些利用生物材料识别的标记,就是生物标志物(biomarker),
它可在危险度评定时,提供人体接触剂量、生物效应和个体易感性的资料。
目前,已建立
了许多分子和细胞生物标志物,如微核、SCE、DNA加合物、癌基因或抑癌基因的过量表
达产物等。
4.人群监测
对那些已知或怀疑接触诱变剂的人群进行筛检,有助于接触量和危险度的评定;
监测
可采用人类生殖细胞和体细胞。
应用生殖细胞的监测有益于评定子代遗传性疾病的危险
度;
应用体细胞的监测可评定接触个体的危险度,而且,检测体细胞致突变效应的方法更
为先进。
以往普遍应用人类血细胞(如淋巴细胞、红细胞)作为“岗哨细胞”,测定接触的生
物标记,提供健康危险的早期警示信号。
现在认为,应用其他易于获得的而更能代表疾病
靶细胞的人类细胞,在危险度评定及疾病预防研究中更为可信。
目前研究较多的细胞类
型包括:
口腔黏膜细胞、鼻腔黏膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞、支气管肺泡灌洗液中的
细胞、脱落的结肠细胞、泌尿道上皮细胞、宫颈上皮细胞。
通常选用的生物标记有:
微核、
p4
DNA加合物、DNA链断裂、非整倍体、程序外DNA合成和基因突变(如K—RAS、P53)等。
人群监测的另一项内容是代谢基因的多态性研究。
现有资料表明,代谢酶基因多态
性影响到诱变剂生物效应和健康或疾病结局,最重要的是细胞色素P一450、谷胱甘肽转
移酶和N一乙酰化转移酶基因。
有人发现P一4501A2的水平可差异40倍或以上,在一
群低剂量吸烟者中,慢NAT2基因型者与快型相比,具有较高水平的加合物,是处于危险
状态的基因型。
GSTMl无效基因型者患膀胱肿瘤的危险度增加了80%。
因此,在危险
度评定时,对易感人群和一般人群的模式将是完全不同的。
5.流行病学研究
应用流行病学调查的方法,如前瞻性调查、回顾性调查、病例对照研究、列队研究等,
调查某一效应物接触者或人群的健康状况或健康危害和结局,提供诱变剂对人群健康危
害,特别是诱发人类生殖细胞或体细胞突变后,所造成后果的人群证据。
遗传毒理学研究内容所获得的资料,为危险评定奠定了信息基础,将最新资料或信
息,建立构一效关系和量一效关系的数据库,并建立多种变数在内的危险度评定的计算机
模式,也将成为遗传毒物危险度评定的重要内容。
二、研究任务
遗传毒理学的主要任务是阐明化学物质或其他环境因子对人体细胞遗传物质的损伤
及对人类的遗传学改变,探讨遗传毒物与基因的交互作用、诱发遗传毒性的机制,对人体
健康的影响与危险度评定,探索遗传毒物对人体早期损害的指标,建立预警体系。
并在此
基础上,采取干预措施,确保人体健康。
三、研究方法
除一般毒理学的研究方法均被应用于遗传毒理学研究外,根据研究对象和内容,还包
括其特有的三部分研究方法。
(一)致突变性试验
致突变。
l生试Nt(mutagenicityassays)是一类用以检测遗传毒性物质的试验。
任何一种
因子在这些试验项目中或其他DNA损伤试验中能引起可重复的阳性反应者,均考虑为
具有遗传毒性作用。
这些阳性反应是基因突变、染色体断裂效应、重组效应、致非整倍体
或多倍体等。
目前,已有多达200种以上的试验用于检测诱变剂,这些试验分别应用微生
物、培养的哺乳动物细胞、植物、昆虫和哺乳动物。
但是,多数还是采用微生物和哺乳动物
细胞培养。
这些试验快速、经济,最多几天可获结果,故常称之为短期测试系统(short-
termtestsystem)。
而最昂贵而费时的哺乳动物试验多用于具有特殊意义的环境因子或
基础研究和危险度评定。
在众多的短期测试系统中,其被广泛应用的是Ames试验和细
胞遗传学试验(详见第十七章)。
但是,通过表型作为观察终点的试验,常常有一定百分比
p5
的假阳性或假阴性。
并且,难以回收突变子进行深入的突变分析。
为此,20世纪90年代
以来,建立了一些分子终点的新方法。
例如基于应用应激基因反应的试验,荧光原位杂交
(Fish)应用于细胞遗传学终点的测定,在内源性和转基因报道基因中评价基因突变,应用
单细胞凝胶电泳试验(Comet试验)可敏感地检测单个细胞中由于毒性引起的直接DNA
损伤,以及由于与细胞死亡相关的DNA降解而引起的间接DNA损伤。
(二)突变的分子分析
现代致突变研究已将遗传学分析和分子分析结合起来,用突变的分子分析(rnolecular
analvsisofmutation)来研究突变的特征。
其方法是:
早期有突变体蛋白与野生型蛋白的
比较,以阐明蛋白质编码基因的变化。
现在对核酸的直接分析,以及DNA技术使致突变
研究取得了革命性的进展。
因为点突变和缺失,通常不能靠表型予以鉴别,但可以通过针
对靶基因的探针和Southern印迹技术,基因突变的特征还可用DNA序列分析。
由此,可
获得基因突变的类型与突变位点(hotspots),揭示化学物质诱发的突变谱,可在分子水平
上揭示突变的特征。
此外,还可应用转基因系统(transgenicsystem)。
该系统通过将作为
靶基iNN--N#bN性DNA序列转染到细胞或动物受精卵的雄性原核,建成转基因细胞
系或转基因动物,以此与受试物接触,分析靶基因的突变率、突变谱,以揭示受试物诱发突
变的特征。
穿梭质粒也已用于研究哺乳动物细胞中的DNA损伤过程,因为穿梭质粒也
携带有检测突变的靶基因。
例如作者建立的pESnx.FL穿梭质粒系统,以邻苯二酚氧化
酶基因为靶基因,构建于EB病毒类质粒pESnx上,转入人新生儿羊膜细胞(FL)而建成
的。
由于它可在哺乳动物细胞中复制,因此,化学物诱发pESnx—FL靶基因的突变,可通
过回收细胞中的靶基因,再转入细菌而检测,并进行序列分析。
而且,成功地建立了携带
邻苯二酚氧化酶靶基因的质粒载体转基因小鼠,已用于遗传毒性评价的研究。
Ames试验
是依靠表型判断化合物是否有诱变性的一项试验,现在采用等位基因特异性寡核苷酸杂
交和DNA序列分析的方法,对Ames试验中获得的回复突变子(revertant)进行分子分析。
上述这些研究方法是常用于遗传毒理学中突变分子分析的方法。
(三)人群监测
已如上述,在评定诱变剂对健康的危险度时,须对接触人群进行监测,以评定接触量
和危险度。
A群监N(humanpopulationInonitoring)的方法可用同一个体接触的前后进行
比较。
以接触前资料为基线,比较接触后的变化。
有的可应用接触人群与相应的对照人
群间进行比较。
对照人群的决定,取决于一些因素,如年龄、性别、吸烟习惯和药物史等。
流行病学调查的原则和方法均可应用于诱变剂接触人群的监测技术,可分为按接触后诱
发生殖细胞和体细胞突变两部分。
检测生殖细胞突变的技术原则是“岗哨表型”(sentinelphenotype)频率的增加,例如
精子畸变率、生殖细胞的染色体畸变,用阿的平对人类精子进行染色,筛选其荧光点可检
测非整倍体,用荧光原位杂交(FISH)技术探针检测精子的特异性染色体;
用变性梯度凝
胶电泳或单股构象多态性分析检测经PCR扩增的DNA片段中的点突变;
用Southern印
p6
迹检测缺失和重排;
用高压液相色谱检测经PCR扩增的DNA裂片中的缺失和双链,应用
寡核苷酸杂交技术检测序列差别,以及在微卫星或高变异度DNA序列分析中分析接触
人群的改变等。
检测体细胞突变的方法更多。
细胞遗传学试验是检测人类接触诱变剂最常用的方
法。
其结果可提供致突变和对人体效应间的直接联系。
分析的指标包括各种结构改变的
染色体畸变率。
现有资料表明,接触离子辐射、苯、煤焦油、环磷酰胺、氯乙烯、镍化合物
等,均可检测到人外周血淋巴细胞的染色体畸变率升高。
微核试验也已用于人群监测。
当前认为,这些指标的升高,虽然尚不能完全解释对人类健康会产生何种后果,但它可证
明人体内细胞的遗传物质受损。
从群体水平上讲,这种损伤是危害性接触的结果,可预示
该群体中的个体处于致突变的危险中。
Hagmar等在1970~1988年间作了一次前瞻性队
列调查,取了l979名受试者的血淋巴细胞做染色体畸变分析,提示高畸变率者发展肿瘤
的危险度高于低、中畸变率者2.5倍。
SCE也曾用于人群监测,但对于其机制尚不清楚,
检出率低于染色体畸变率,仍存在混杂因素的变异,但因其对低剂量较敏感也可作为一种
接触的指示。
内源性基因突变的分析,是人群监测很好的方法,例如,淋巴细胞的hprt试
验。
Cole等报道,hprt突变率的增加与肿瘤的化疗、放疗、放射免疫球蛋白治疗、吸烟和、
职业性接触氧乙烯等相关。
还有HLA(histoncopatibilitycomplex)、CD3/TCR(CD3/T—
cellreceptorcomplex)试验用于检测7号和l4号染色体CD3/TCRcomplex编码成分的基
因突变等。
此外,还可通过非遗传学生物标记物的检测,用于指示是否存在诱变剂的接
触。
例如,检测尿中的代谢产物和DNA修复产物,测定血和其他组织中的DNA或蛋白
质加合物,Ribeir0等的观察结果说明,在接触氧乙烯后,加合物的量与染色体畸变、微核、
SCE、hprt突变频率等增加均有显著的相关性。
还有,测定尿中的诱变剂也可提示诱变剂
的接触。
随着分子生物学技术的广泛应用,人群监测的方法必将进一步发展,从而建立更
多灵敏、特异而与人体健康效应密切相关的方法。
第三节遗传毒理学的历史[3~5]
一、遗传毒理学的由来
遗传毒理学作为一门独立的学科,究其起源,可追溯至20世纪初,早在1990年,欧
洲的一些科学家,如荷兰的deVries,德国的Correns,奥地利的Tschermak就已研究了某
些化学、生物及物理因素怎样和为什么会导致遗传学改变。
这些工作促进了遗传学的迅
猛发展,加速了对基因的研究,并使人们思考外来因素是怎样影响基因序列发生改变的问
题。
对于这种改变,欧洲的科学家们用“mutation”这个词来描述,“mutation"
来源于拉丁
语的“mutare”,是改变(tochange)的意思。
后来,该词就被用来描述基因在数量、质量和
排列序列上的改变。
1904年,即发现X射线9年以后,deVries在美国作学术报告指出:
X射线能改变生
殖细胞的遗传物质。
这是美国科学家们第一次了解这一新的研究领域。
从1905年起,大多数科学家们的研究工作都集中于放射线对细胞的遗传的影响,但
也有些科学家对化学物质的诱变性发生兴趣。
最早关于化学物质诱变性的报告来自德国
p7
的两位研究生Franz和Elizabeth,他们分别采用细菌和真菌对一些氧化剂如铬酸钾、氯酸
钾、硫化锌和氧化铜进行了研究,当然他们的研究选用的材料是不理想的,实验结果也是
不明确的,但他们的工作开创了一个新的研究领域,即化学物质的诱变作用,并在20世纪
的前30年中,取得了许多有意义的成果。
1927年,美国的Maller报告X射线是一种明确的诱变因子,他同时提出了“突变率”
的概念,并发明了用果蝇进行检测的方法。
另外,也有许多科学家对化学物质如乙醇、乙
醚、吗啡、奎宁、氨、乙酸、碘、高锰酸钾和其他一些金属进行了研究,但这方面的结果与放
射线诱变性方面的研究所取得的成功相比是相形见绌的。
直到40年代,情况才发生了变
化。
1942年Charlotte和Robson发现芥子气具有诱变性。
1943年Franzoechlkers发现广
泛应用的氨基甲酸乙酯有诱变性。
在1946年和l948年,Rapoport的研究结果表明环氧
乙烷、乙烯亚胺、环氧丙烷、重氮甲烷、二乙基硫酸、缩水甘油和其他一些化学物质具有诱
变性。
这些研究结果表明化学物质的诱变作用也是一个明确的研究领域。
在20世纪40年代后期,科学家开始注意到诱变与致癌之间的关系。
l938年,一些
致癌性的碳氢化合物就已被证实具有诱变性,在这方面的研究上,Mtiller起了很大的推动
作用,他在1927年和l934年就曾指出:
放射线诱发的体细胞的突变可导致癌和白血病
等。
20世纪50年代中期,遗传毒理学的发展翻开了新的一页。
1956年德国植物学家
Alfred在他的题为“诱变药物”一文中指出:
许多具有诱变性的化学物质被应用于医药、食
品和化妆品工业中。
对这些化学物质不仅需要研究它们的疗效和毒性,还要考虑它们可
能具有的细胞遗传学方面的副作用。
与此同时,越来越多的科学家也注意了这个问题。
例如斯坦福大学的诺贝尔奖金获得者Joshua也提出研究化学物质对人类生殖细胞可能
的危害性是必要的。
直到60年代,对化学物质遗传毒性评价的必要性才得到应有的重
视。
l960年,在德国举行的第一届ErwinBauer纪念讲演会上,Charlotte在他的题为“化
学物质对动物的诱变作用”论文中指出:
随着越来越多的化学物质在医疗和食品等方面的
应用,对它们的诱变性的检测将是一种必要的保护措施。
1962年,在美国召开了由23位
杰出的遗传学家参加的会议。
这次会议第三部分的主题就是“诱变物对人类和其他物种
的诱变性“。
会议上,斯坦福大学的药理学家Auram认为决不能忽视化学物质诱变性对
人类的影响。
同年Sobels在他为WH0提供的论文中提出了化学诱变物在人类环境中不
断增长的问题。
1963年Miiller在访问FDA时应邀作学术报告。
作为遗传学的放射诱变
研究方面的先驱,他并没有回忆历史而是谈到他对人类健康的关注。
他认为:
现代人所接
触的许多物质如食品添加剂、药物、尼古丁、抗生素、杀虫剂、避孕药,以及空气和水的污染
都是前人所未遇到的。
由于Maller等的影响,越来越多的科学家开始讨论这个问题,并召开了许多关于这
方面的会议。
l966年9月由NIH的遗传学分会发起召开了“人工合成化合物的诱变性
对人类的危害”会议。
在这次会议上,有许多提议成为后来建立的环境诱变剂学会的基本
目标。
A1exander(遗传毒理学的奠基者之一,他的工作推动了遗传毒理学的建立)和其他几
位在遗传毒理学的创立中起重要作用的科学家(Frederick,Heinrich,Marvin,Ernstand
p8
Samuel)酝酿建立一个关于环境中化学物质的诱变性方面的学术机构,鼓励开展这方面的
研究活动并进行学术上的交流。
于是在1968年他们组成一个特别委员会,并对100位科
学家进行了调查,结果表明,这样一个机构的建立是有益的。
1969年3月12日,根据当时已知的诱变物ethylmethanesulfonate三个词的第一字
母EMS命名的“环境诱变剂学会(EnvironmentalMutagenSociety,EMS)”正式成立。
近
30年来,有关致突变的基础研究因致突变试验的确立而有了很大的发展,诱变研究内容
也正逐步地被纳入毒理学的广泛领域中,一些国家的或国际性机构对诱变也有了极大的
兴趣,并认识到其对遗传性疾病和致癌的重要关系。
在美国,如NIH、NTP、EPA、FDA和
能源部某机构均支持有关诱变的基础研究。
这些努力促使人们去研制、生产更为安全的
化学产品。
二、遗传毒理学在我国的发展
我国广泛地开展遗传毒理学的研究工作,始于20世纪70年代末。
20多年来,发展
迅速,至今已由少数实验室的开拓性工作,普及到各种相关实验室,已广泛应用于基础医
学、临床医学和预防医学的研究中,并列入新药研究、环保监测、农药开发、新型生物材料
研制等一切涉及人类健康或安全性评价的规定检测项目。
科学研究工作也逐步深入,目
前有些工作已与国际同类研究水平相当。
20多年来,我国遗传毒理学的发展可大致划分为三个阶段:
第一阶段:
自70年代末到l983年,当时我国遗传毒理学研究工作尚处于起步阶段,
这一时期我们从国外引进了一系列经典的遗传毒性检测方法,逐步在国内建立起相关实
验室,展开了这方面的研究工作,并大量过筛了我国人群中所接触的化学物质及其他环境
因子的遗传毒性。
与此同时,加强对专业人员的培训也是当时学科建设的一个关键所在。
许多国外知名的遗传毒理学专家曾被邀请到国内进行指导、交流;
同期,国内也有大量的
专业人员陆续被派往国外访问、学习,此举有力地推动了学科的进步。
1983年中国环境
诱变剂学会(CEMS)的成立标志着国内已组织起一支遗传毒理学专业人员的队伍,成为
国内及国际间专业学术交流及研究活动的组织者。
第二阶段:
自1983~1993年,这是学科全面深入发展的阶段。
遗传毒性的检测方法
逐步走向标准化、规范化。
同时,对遗传毒性机制的研究也成为科研的一个重点方向。
而
这一时期具有重大意义的是在我国各种新药、农药、工业化学品、食品
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