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2.酸碱滴定的结果:
蛋白质分子中含有的自由氨基和羧基较少
随着水解的进行,游离氨基和羧基等摩尔数增加
氨基酸分子中的氨基和羧基在构成蛋白质大分子时,参与了某种结合
3.1902年Fischer人工合成了18肽
18肽能被蛋白酶水解且呈现双缩脲反应
进一步确证了蛋白质分子中的氨基酸之间是通过肽键相互连接的
肽:
一个氨基酸的α羧基与另一个氨基酸的α—氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽
由两个氨基酸组成的肽称为二肽
由三个氨基酸组成的肽称为三肽
由5个氨基酸组成的一个五肽的结构如图
小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽
大于10个氨基酸组成的肽称为聚肽或多肽
某些肽中有非α-羧基和α-氨基之间形成的肽键
如谷胱甘肽分子中,谷氨酸的γ-羧基和半胱氨酸的α-氨基之间形成肽键
该肽键很稳定,不易被蛋白酶作用
肽链结构有主链侧链
主链骨架是指除侧链R以外的部分
把肽链中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基
任何一个肽,在肽链的一端仍有自由的氨基,
称为氨基末端(或N端)
另一端仍有自由的羧基
称为和羧基末端(或C端)
2.肽的命名及结构
根据所含的氨基酸残基数简单地称为二肽、三肽和四肽
但肽的命名一般是根据其功能和来源
脑啡肽脑抽提液吗啡样活性物质
两种形式的脑啡肽,均由5个氨基酸组成
蛋氨酸脑啡肽,H—Tyr-Gly-Gly-Phe—Met—OH
亮氨酸脑啡肽,H—Tyr-Gly-Gly-Phe—Leu—OH
自然界中肽开链式结构环状结构
环状肽,没有自由氨基端和自由羧基端
在微生物中常见,如短杆菌肽S
含两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应
除二肽外,肽都有双缩脲反应
3.肽链表达式
一般用氨基酸中文名称的字头表示,中间用“.”号或“—”号将它们隔开
甘·
丙·
丝·
缬·
亮·
蛋·
赖·
精·
谷
在书写时,含自由氨基的一端总是写在左边
含自由羧基的那端总是写在右边
也可用氨基酸英文名称的三字符或单字符缩写表示,中间用“.”号或“—”号将其隔开
G1y-A1a-Ser-Val-Leu-Met-Lys-Lys-Arg-Glu
G-A-S-V-L-M-K-K-R-E
有些肽的氨基端是乙酰化的
如细胞色素C氨基端的甘氨酸是乙酰甘氨酸
应写出
有些肽的羧基端是酯化的或酰胺化的
如催产素羧基端的甘氨酸为酰胺化的甘氨酸
也应写出
4.一级结构研究
内容包括蛋白质的氨基酸组成,氨基酸排列顺序和二硫键位置,肽链数目,末端氨基酸的种类等
20世纪40年代一级结构研究大难题
英国生物化学家桑格破
桑格多肽链中氨基酸排列顺序测
定的开拓者
胰岛素分子小,代表性
用了十年的时间
1953年首次报道胰岛素全部氨基酸排列顺序
目前蛋白质顺序分析测定方法有了改进
自动化程度很大的提高
基本的方法是相同的
一级结构测定的基本方法有如下:
1)一定量蛋白质纯品且分子量已知
将一部分样品完全水解
确定该蛋白质中的氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量
2)进行末端分析
a确定该种蛋白质的肽链数目
根据蛋白质N-端或C—端的摩尔数和蛋白质的相对分子量来确定蛋白质分子中多肽链数目
如果蛋白质分子只含一条多肽链,蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数相等;
如果后者是前者的倍数,蛋白质分子则含一条以上的多肽链;
如果检测到的末端基多于一种,表明蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成。
bN—端和C—端各是什么氨基酸
1N-末端分析
a.2,4—二硝基氟苯(FDNB)法。
在弱碱性pH8~9下,多肽链N端氨基酸与FDNB试剂反应生成一种二硝基苯肽(DNP-肽)
后者经酸水解,可得到黄色的二硝基苯氨基酸(DNP-氨基酸)和其他氨基酸的混合液
其中只有DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯
故用乙酸乙酯抽提将抽提液进行色谱分析
并用标准的DNP-氨基酸作为对照可鉴定之
侧链氨基也有此反应,但反应较慢,且生成的DNP-氨基酸不溶于乙酸乙酯,而保留在水相
b.Edman降解法
瑞典科学家P.Edman建立的
蛋白质多肽链N端氨基酸与苯异硫氰酸酯
在弱碱性条件下苯氨基硫甲酰肽PTC-肽
酸性条件PTC-肽环化生成PTH-氨基酸
N端少了一个氨基酸的肽链
在酸性条件下,生成的PTH-氨基酸极稳定
用乙酸乙酯抽提,PTH-氨基酸溶于乙酸乙酯
经高压液相层析鉴定可知N端是什么氨基酸
该法优点:
可连续分析出N端的十几个氨基酸
自动顺序分析仪的反应原理
c.丹磺酰氯法,DNS法
1963GirayandHartley
5-二甲氨基萘-1-磺酰氯,简称丹磺酰氯
可与多肽链N端氨基酸的氨基反应
生成丹磺酰肽(DNS-肽)
后者经酸水解产生DNS-氨基酸(具有荧光)和其他游离的氨基酸
用乙酸乙酯抽提,可得到DNS-氨基酸
用色谱分析可鉴定之该法灵敏度很高
②C-末端分析
a.肼解法(NH2NH2)
多肽链过量无水肼100℃反应5~10h
除C-端氨基酸外,其他氨基酸氨基酸酰肼
加入苯甲醛氨基酸酰肼转变二苯基衍生物
不溶于水
离心分离C-端氨基酸在水相
水相中2,4-二硝基氟苯与C-端氨基酸反应
经色谱可鉴定之
b.羧肽酶法
羧肽酶A:
当C端为赖氨酸、精氨酸和脯氨酸时
或倒数第二个氨基酸是脯氨酸时
该酶均不能作用;
Lys(Arg,Pro)(不能作用)
ProX(任一氨基酸)(不能作用)
羧肽酶B(CPB):
C端是赖和精时能作用
但倒数第二个氨基酸为脯时该酶不能作用
3)肽链的拆分
蛋白质有两条以上的肽链组成应将其拆分开
肽链之间非共价键连接:
可使用一切使蛋白质变性的试剂
肽链之间共价键相连(主要是二硫键)
可采用过甲酸氧化或巯基乙醇还原的方法
Sanger胰岛素2,4-二硝基氟苯法
得到一个DNP-甘氨酸一个DNP-苯丙氨酸确知胰岛素有两条肽链组成
用过甲酸氧化,电泳或色谱法分离得到两个肽段
一个含酸性氨基酸多,N-末端为甘氨酸A链
另一个含碱性氨基酸多,N-末端为苯丙氨酸B链
4)肽链中氨基酸排列顺序的确定
一般使用片段重叠法
专一性的蛋白水解酶或化学试剂
使蛋白质的多肽链在特定的部位断裂
产生一些大小不同的重叠片段
常用的断裂多肽链的方法有:
1溴化氰(CNBr)裂解法
它专一性水解甲硫氨酸的羧基形成的肽键
产生以高丝氨酸内酯结尾的肽
2胰蛋白酶水解法
专一水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键
但如果赖氨酸和精氨酸的羧基与脯氨酸相连
则该酶不能作用
3胰凝乳蛋白酶水解法
专一性水解疏水性氨基酸酪、苯丙、色氨酸的羧基形成的肽键
若与它们的羧基相连的氨基酸为脯氨酸,该酶不能水解
5)分离纯化部分降解的肽片段
分析每一片段的氨基酸组成和排列顺序
6)确定二硫键的位置
7)根据重叠肽的氨基酸顺序
推出完整肽的氨基酸顺序
从下列资料推出一条肽的氨基酸顺序:
1).含有Phe,Pro,Glu,Lys
(2)
2).Edman试剂处理生成PTH-Glu
3).用胰蛋白酶、羧肽酶A和B处理都不能得到任何较小的肽和氨基酸
一四肽与FDNB反应后,用6mol/L盐酸水解得到DNP-Val及其他三种氨基酸。
但这种四肽用胰蛋白酶水解,可得到两个二肽,其中一个肽可发生坂口反应,另一个肽用LiBH4还原后进行水解,水解液中发现有氨基乙醇和一种与茚生酮反应生成棕褐色产物的氨基酸,试问在原来的四肽中可能存在哪几种氨基酸,他们的排列顺序如何?
二、蛋白质的二级结构
1.二级结构的概念(secondarystructure)
主要指多肽链的主链骨架盘绕折叠时形成的结构
二级结构与侧链R的构象无关
多肽链的基本结构
多肽链主链形式上都是单键
一个多肽主链将可能有无限多种构象
X衍射法蛋白质只有一种或很少几种构象
多肽链的折叠受到了某种限制
进一步的发现是蛋白质结构的基本单位--肽单位在空间上限制了多肽链的旋转和折叠
肽单位是多肽链中从一个α碳原子到相邻α碳原子之间的结构
肽单位的构象具有三个显著的特征:
(1)肽单位是一个刚性的平面结构
肽键中C—N键0.132nm比一般的C—N单键0.147nm要短些
比一般的C=N双键0.128nm要长些
具有部分双键的性质,不能自由旋转
肽单位所包含的六个原子处于同一个平面上
这个平面又称为酰胺平面或肽平面
(2)肽平面中羰基的氧与亚氨基的氢可以有顺式和反式两种排布
X衍射结果证实,多肽链中绝大多数肽单位上羰基的氧和亚氨基的氢都以反式存在
仅X-Pro之间的肽键可以是顺式的
脯氨酸的吡咯烷环δ碳原子在反式时易与邻近的氨基酸侧链发生空间排斥
而顺式脯氨酸肽键有利于肽链在此处转折
(3)Cα和亚氨基N及Cα和羧基C之间的键都是单键,均可以自由旋转的
Cα--N键旋转的角度用φ表示
Cα--C键旋转的角度用ψ表示
它们被称为Cα原子的二面角
φ角以Cα--C键对N--H键呈反式时为0
ψ角以Cα—N键对C--O键呈反式时为0
相邻的两个酰胺平面通过Cα相对旋转的程度决定了两个相邻的肽平面的相对位置
肽单位的二面角都可以在0~180范围内变动
使肽链出现多种不同二面角的主链构象
肽平面的存在限制了主链所能形成的构象数目
2.二级结构的主要类型
Pauling,Corey建立了多种分子模型
目前被公认的主要有两个结构模型
分别称为α-螺旋结构和β-折叠结构
(1)α-螺旋(α-helix)
α-螺旋的结构
类似棒状的结构
紧密卷曲的多肽链构成棒的中心部分
侧链R伸出到螺旋排布的外面
酰胺平面与螺旋的纵轴是平行的
完成一个螺旋,需3.6个氨基酸残基
螺旋每上升一圈,相当于向上平移0.56nm
相邻两个氨基酸残基之间的轴心距为0.15nm
α—螺旋结构的稳定(主要链内的氢键)
第一个氨基酸的羧基与线性顺序中的第五个氨基酸的氨基之间氢键形成
氢键环内包含13个原子
因此这种螺旋由称为3.6(13)螺旋。
α-螺旋的国际表示法,以ns表示
n指每个螺旋中所包含的氨基酸残基数
s指氢键环内共价键所连接的原子数
α-螺旋大多为右手螺旋
一条肽链α-螺旋结构的形成与它的氨基酸组成有关
甘氨酸、脯氨酸不易形成α-螺旋结构
两个或两个以上相邻的残基上带有相同的电荷时
多聚赖氨酸和多聚谷氨酸不易形成α-螺旋结构
两个或两个以上相邻的氨基酸残基上带有较大的侧链时,都会阻止α-螺旋结构的形成
Ile·
Ile
Val·
Val·
Val,
Leu·
Leu·
Leu
连续的几个丝氨酸或苏氨酸,由于羟基与氢键有强烈相吸的倾向,而破坏α螺旋的形成
不同蛋白质中α-螺旋含量不同
肌红蛋白、血红蛋白,主要由α-螺旋结构组成
γ-球蛋白、肌动蛋白中几乎不含α-螺旋结构
有的蛋白质,如毛发中的α-角蛋白,是以α-螺旋作为基本结构的
(2)β-折叠结构(β—pleatedsheet)
β-折叠片层结构、β-结构等
它是肽链主链或某一肽段的一种相当伸展的结构
多肽链呈扇面状折叠
一般需要两条或两条以上的肽段共同参与
两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起
相邻肽链主链上的氨基和羰基之间形成有规则的氢键维持这种片层结构的稳定
β-折叠结构的特点如下:
所有的肽键都参与了链间氢键的形成
氢键与肽链的长轴近于垂直
多肽主链是比较伸展的,取锯齿状折叠构象
相邻的两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm
侧链R交替地分布在片层平面的上方和下方,以避免相邻侧链R之间的空间障碍
β-折叠结构有平行和反平行两种
反平行相邻肽链的走向相反,但氢键近于平行
平行相邻肽链的走向相同氢键不平行
(3)β转角结构β-转角结构、β-弯曲、β回折
蛋白质分子的多肽链在形成空间构象时,经常会出现180的回折(转折),回折处的结构就称为β-转角结构
一般由四个连续的氨基酸组成
第一个氨基酸的羧基和第四个氨基酸的氨基之间形成氢键
甘氨酸和脯氨酸易出现在这种结构中
如嗜热菌蛋白酶中有三个连续的氨基酸形成的β-转角结构
氢键形成于第一个氨基酸的羰基氧和第三个氨基酸的亚氨基氢之间
580多种蛋白质X-射线晶体衍射法结构分析
有些蛋白质几乎全是由α-螺旋结构组成的
有些蛋白质几乎全是由β-折叠结构组成的
而有些蛋白质分子中α-螺旋和β折叠结构都存在;
四、超二级结构和结构域
(一)超二级结构
M.Rossmann,1973年超二级结构
蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中往往形成有规则的二级结构聚集体
如α-螺旋聚集体(αα型)
一些纤维状蛋白质如肌球蛋白、纤维蛋白原等
球状蛋白质如烟草花叶病毒的外壳蛋白中
有ββ-折叠的聚集体ββ
α螺旋和β-折叠的聚集体βαβ
Rossmann卷曲:
在球状蛋白质中尤其常见的是两个βαβ聚集体连在一起形成βαβαβ结构
这种由二级结构间组合的结构层次称为超二级结构
超二级结构一般以一个整体参与三维折叠,充作三级结构的构件
(二)结构域
1973,Wetlaufer结构域domain
介于二级和三级结构之间存在的另一种结构层次
结构域:
蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域,又称为辖区
较大的蛋白质两个或多个空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构
较小的蛋白质结构域三级结构一个意思
结构域自身是紧密装配的
结构域与结构域之间关系松懈
常常有一段长短不等的肽链相连
两个结构域之间有一明显的“颈部”或称为“凹口”形成所谓铰链区
不同的蛋白质分子中,其结构域的数目不同
同一蛋白质分子中的几个结构域,彼此相似或者很不相同
常见结构域的氨基酸残基数在100~400个之间
最小的结构域只有40—50个氨基酸残基
大的结构域可超过400个氨基酸残基
如免疫球蛋白分子中的结构域
免疫球蛋白有多种,但都有两类肽链组成
一类相对分子质量较小,称为轻链,用L表示
另一类相对分子质量较大,称为重链,用H表示
免疫球蛋白G分子由两条轻链和两条重链组成
五、球状蛋白质的三级结构
1958Kendwer等用X射线法
抹香鲸肌红蛋白三级结构
在球状蛋白质中,多肽链不是简单地沿着某一个中心轴有规律地重复排列,而是沿多个方向进行卷曲、折叠,形成一个紧密的近似球形的结构
侧链R的相互作用对稳定球状蛋白质的三级结构起重要的作用
三级结构包括多肽链中一切原子的空间排列方式
在球状蛋白质中,亲水基团多位于分子表面
而疏水基团多位于分子的内部,形成疏水的核心
肌红蛋白肌肉负责运输氧
一条肽链含153个氨基酸和一个血红素辅基
相对分子质量为17800
主链的75%是α-螺旋
分子中有八段螺旋区:
分别用A,B,C,D,E,F,G,H表示
每段螺旋区含有大约7—8个氨基酸残基
最长的有大约23个氨基酸残基组成
分子中还含有7段非螺旋区
含4个脯氨酸,均处于拐弯处
①N—端有2个氨基酸组成的一段
②A和B螺旋之间③C和D螺旋之间
④E和F螺旋之间⑤F和G之间
⑥G和H之间
⑦C端有5个氨基酸组成的一段
由于侧链的相互作用,使得多肽链折叠、盘绕成内有袋形空穴的紧密结构
肌红蛋白分子内部几乎全为非极性氨基酸残基
只有His93(F8)和His64(E7)在分子内部参与其结合氧功能的调节
血红素辅基垂直地伸出在分子的表面,并通过93位组氨酸残基和64位组氨酸残基与肌红蛋白内部相连
在肌红蛋白分子的空穴中
由于远位的His64等残基存在于第六配位键附近,通过位阻而阻止了血红素与氧形成中间复合物,避免了Fe2+的氧化,仅出现电子暂时重排的氧结合,使其能持续发挥其结合氧的功能
维持蛋白质三级结构稳定的力主要是非共价键
(1)氢键:
1936年PaulingMirsky提出
氢键是保持肽链折叠结构的主要因素
它在维持蛋白质空间构象中起着重要的作用
当氢原子与一个电负性较大的原子形成共价键时,氢原子带有正电性,可与另一个电负性较强的原子形成氢键,如下所示:
A-H----B
A和B是电负性强的原子,A是质子供体,B是质子受体;
氢键的键能较小
在蛋白质分子中有多个可形成氢键的基团,如主链的肽键之间可形成氢键
侧链与主链之间、侧链与侧链之间都可以形成氢键
尿素与胍盐类可与蛋白质分子中的氢键供体及氢键的受体竞争形成氢键,使蛋白质变性,故它们是氢键的破坏者
(2)疏水的相互作用:
疏水基团为避开水相而相互靠近
蛋白质分子疏水的氨基酸
疏水侧链相互靠近趋向于分子内部以减少其与水的界面,这是蛋白质空间构象形成的驱动力之一
(3)范德华力:
指一般原子、分子间或基团之间的短程作用力
它随着分子之间距离的增加而迅速减弱
由于非极性基团有偶极距与诱导偶极距,它们之间会产生吸引力
(4)离子键(盐键):
存在于带相反电荷的基团之间的静电吸引力
两个带电基团在没有成键时,其周围都定向地排列着水分子
两个带相反电荷的基团一旦接近,周围有一部分水分子将被释放到自由水中,使其有序的排列被打乱,因此盐键的形成过程也伴随着熵的增加
(5)配位键:
指在两个原子之间,由其中的一个原子单独提供电子对而形成的一种特殊共价键
多存在于含金属的蛋白质分子中
螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)可除去蛋白质中的金属离子,使配位键不能形成
稳定蛋白质三级结构的力主要是非共价键
此外在某些蛋白质中还有二硫键
侧链与主链间或侧链与侧链间的氢键
六、蛋白质的四级结构
蛋白质的四级结构:
由数条具独立的三级结构的多肽链彼此通过非共价键相互连接而成的聚合体结构
在具有四级结构的蛋白质中,每一个具有独立的三级结构的多肽链称该蛋白质的亚单位(亚基)
亚单位一般只有一条肽链组成,亚单位单独存在没有生物学活性
在一种蛋白质中的亚单位可以相同,也可以不同
亚单位一般以α、β、γ等命名
如血红蛋白分子中含有2个α亚单位和2个β亚单位
亚单位的数目一般为偶数
个别为奇数,如荧光酶分子中含三个亚单位
亚单位在蛋白质中的排布一般是对称的
由两个亚单位组成的蛋白质一般称为二聚体蛋白质
由四个亚单位组成的蛋白质一般称为四聚体
由多个亚基组成的蛋白质一般称为寡聚蛋白质或多体蛋白质
但并非所有的蛋白质都有四级结构
蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构和四级结构示意图及其相互关系蛋白质的结构层次从低到高可表示为:
一级结构:
肽链结构,指多肽链中的氨基酸排列顺序
二级结构:
多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构
超二级结构:
相邻二级结构的聚集体
结构域:
在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构
三级结构:
球状蛋白质中所有原子在空间中的相对位置
四级结构:
亚基聚合体
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