细菌的培养法Word格式文档下载.docx

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2．接种环、接种针、酒精灯、记号笔、试管架等

方法

1.平板划线接种法

（1）标记在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、班级、日期等。

（2）灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置火焰中烧灼灭菌，如

图1-1，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火

焰，如此2～3次。

图1-1接种环的灭菌操作

然后将接种环移开火焰，待其冷却。

注意，接种环不能距离火焰过远，一般应在距火焰10cm范围之内（视此范围为无菌环境）；

灭菌后的接种环不能再碰及他物。

（3）取菌种

左手持装有葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管棉塞，将试管管口迅速通过火焰2～3次进行灭菌。

将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的混合菌液，然后退出菌种

管。

将菌种管管口再次通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞，放至原来的位置。

（4）分离划线接种细菌（见图3-1）

左手持琼脂平板培养基（将皿盖反放在桌上酒精灯附近），尽量使之直立以免空气中

的细菌落入其中，并靠近火焰。

右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄

膜（约占平板面的1/10），视为一区。

划线时使接种环与平板面成30～40度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。

切记，接种环不应嵌进培养基内，避免将琼脂表

面戳破。

旋转琼脂平板90度。

烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表

面以使其冷却。

灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5），此为二区。

注意接种环只通过薄膜1～2次，以获取薄膜处少量的细菌。

烧灼接种环灭菌并使之冷却。

将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板1/4），此为三区。

接种环只通过二区1～2次以获得少量细菌。

接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此为四区。

注意各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。

（5）划线完毕，将琼脂平板放进皿盖，将培养皿倒放（这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落），送进37℃温箱培养。

（6）培养18～24小时后将培养皿取出。

观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。

12

34

图1-2四区划线接种法

2.斜面培养基接种法

（1）用记号笔在待接种的培养管上写明标记。

（2）点燃酒精灯。

（3）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管，使菌种管位于左侧，斜面部均应向上，勿成水平，以免凝结水浸润培养基表面，甚至沾湿棉塞。

（4）以右手拇指和食指捏持转动两管棉塞，以便在接种时易于拔取。

（5）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌。

（6）以右手手掌及小指，小指及无名指分别拔取并夹持两管棉塞，将两管管口灭菌。

（7）将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管（注意，一要防止取菌过多；

二要防止弄破培养基表面）。

再伸进待接种的培养基管，如图3-2进行斜面培养基接种，从斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养基表面。

沾有细菌的接种环进出试管时不应触及到试管内壁和试管口。

（8）接种完毕，灭菌两试管的管口，塞好棉塞，并放至原来的位置上。

重新烧灼接种

环，灭菌后放回试管架上。

接种好的试管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长情况。

图1-3斜面培养基接种法

3.液体培养基接种法

（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。

（2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及待接种的肉汤管。

（3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处

轻轻研磨，蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中（见图3-3）。

塞好试管棉塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。

（4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。

肉汤管放37℃温箱培养，18～24小

时后观察生长情况。

图1-4液体培养基接种法

4.穿刺接种法

（2）如斜面培养基接种法，握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。

（3）右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，如图3-4垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，刺达近管底部，但不必及于管底，然后循原路退出。

（4）接种完毕，接种针重行灭菌后放至试管架上，塞好棉塞，37℃培养18～24小时后取出观察细菌的生长情况。

图1-5穿刺接种法

实验二细菌的形态与结构

各种细菌在一定环境条件下，有相对恒定的形态与结构。

了解细菌的形态与结构是鉴别细菌的重要方法之一。

此外，对分析细菌的致病性和免疫发生的机理等方面，也有一定的意义。

目的要求观察细菌的基本形态和一些细菌的特殊结构。

一、细菌的基本形态

细菌在适宜的生长繁殖条件下所显示的形态可分为三大类：

球菌、杆菌和螺形菌。

不同的细菌又可表现出不同的排列方式，在细菌的鉴别上有一定的参考价值。

1.球菌示教片葡萄球菌、链球菌和肺炎链球菌

2.杆菌示教片大肠杆菌和炭疽杆菌

3.螺形菌示教片霍乱弧菌方法

1.使用显微镜的油镜观察球菌、杆菌和螺形菌的示教片。

2.注意各菌的形状、大小、排列方式等特点（注意：

细菌染成什么颜色不是本实验要求，染色方法将在以后实验中实际操作）。

结果记录

细菌形状

细菌排列方式

二、细菌的特殊结构

细菌的特殊结构仅为某些细菌所具有，而且特殊结构的形成受到一定条件的限制。

虽然特殊结构不是细菌生存所必须的，但他们的存在将赋予细菌一定的功能，在致病性、抗原性、以及对细菌的鉴别上都有一定的意义。

1.破伤风梭菌示教片（示芽胞）

2.肺炎链球菌示教片（示荚膜）

3.变形杆菌示教片（示鞭毛）方法

1.使用显微镜的油镜，观察细菌的芽胞、荚膜和鞭毛的示教片。

2.注意芽胞在菌体上的位置和大小；

荚膜的大小及其与菌体的关系；

注意鞭毛形态、数量及其位置。

将所观察到的细菌特殊结构的形态特点记录于下表中。

细菌破伤风梭菌肺炎链球菌变形杆菌特殊结构

实验三革兰染色法

活的细菌为无色半透明状，在普通光学显微镜下不易观察清晰。

若用染色的方法可使菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，可在显微镜下清晰地观察其形态。

细菌的染色方法很多，其中最为广泛使用的一种鉴别染色法是由丹麦医生Christian

Gram于1884年创建的革兰（Gram）染色法。

利用此法可将细菌分为革兰阳性细菌和革兰阴性细菌两大类。

革兰阳性菌因细胞壁中含有大量的肽聚糖和磷壁酸，可保留结晶

紫与碘的复合物，并不被酒精脱色而显示为蓝紫色。

革兰阴性菌因其细胞壁中肽聚糖含

量少，脂类物质含量高而被酒精脱色，经复染呈红色。

目的要求了解革兰染色的原理，掌握革兰染色的方法。

1.菌种葡萄球菌、大肠杆菌培养物

2.染液结晶紫染液、卢戈（Rugol）碘液、95%酒精和沙黄染液

3.其他玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水等方法

1.涂片

取洁净玻片1张，作好标记后置实验台上。

点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置火焰中烧灼灭菌。

用灭菌的接种环取无菌生理盐水2环，分别置于玻片左右两处。

然后左手持培养物琼脂平板；

右手仍以持笔式将接种环再次放在火焰上灭菌，待接种环冷却后，挑取单一金黄色葡萄球菌菌落适

量培养物，将培养物琼脂平板放回皿盖。

然后将挑取的细菌混合于其中一处的盐水中，

涂抹均匀使成一层薄膜（若检材是液体，则不必加盐水），薄膜涂抹的面积约1.5×

2.0cm2。

按上法制备大肠杆菌涂膜。

2.于室温中自然干燥。

3.固定涂片在酒精灯火焰上快速通过3～4次以固定细菌，并使其不易从玻片上脱落。

注意不要将涂片直接放在火焰上烤，以免破坏细菌结构。

4.染色

（1）初染在涂膜上滴加结晶紫染液1～2滴，染1分钟，水冲洗，并轻轻倾去玻片上的积水。

（2）媒染加卢戈碘液1～2滴，染1分钟，水冲洗。

将表面积水甩干。

（3）脱色用95%酒精数滴滴于玻片上，频频摇晃以脱色，半分钟左右，立即用水冲洗（若涂膜较厚，可延长脱色时间；

必须随时观察，以免脱色过度）。

（4）复染最后滴加沙黄染液1～2滴，复染1分钟后用水冲洗。

最后用吸水纸吸干。

5.用显微镜的油镜观察染色结果，将实验结果记录于下表中。

实验四抗酸染色法

结核分枝杆菌是引起结核病的病原体，菌体细长略弯曲，有分枝生长趋势，因其细胞壁含有大量脂质，一般不易着色，若经加温或延长染色时间或提高染液浓度而着色后能抵抗盐酸酒精的脱色，故又称抗酸杆菌。

目的要求学习抗酸染色方法。

1.开放型肺结核病人痰标本涂片和枯草杆菌涂片

2.抗酸染色剂（石炭酸复红染液、3％盐酸酒精、碱性美蓝染液），载玻片方法

1.染色

①在已固定的涂片上滴加石炭酸复红液数滴，染色8～10分钟，水冲洗。

②滴加3％盐酸酒精脱色，至复红的颜色不再继续脱下为止，时间为半分钟至1分钟，水冲洗。

③滴加碱性美蓝液2～3滴，1分钟后水冲洗。

④用吸水纸把玻片吸干，油镜检查。

2.抗酸染色标本镜检

结核杆菌为抗酸染色阳性，在蓝色背景下可见染成红色的细长或略带弯曲的杆菌，有分枝生长趋向，有时菌体内可含浓染颗粒，呈念珠状。

Expperiimentt1HandlingandExaminingCultures

Introduction:

Toobtaininformationaboutbacteriabiologiccharacteristics,itisnecessarytoobservemicroorganismsinculture.Ifwearetocultivatethemsuccessfullyinthelaboratory,wemustprovidethemwithsuitablenutrients,

suchasproteincomponents,carbohydrates,minerals,vitamins,andmoistureintherightcomposition.Thismixtureiscalledaculturemedium.It

maybepreparedinliquidform,asabroth,orsolidifiedwithagar.Agarmediummaybeusedintubesasasolidcolumnorasslants.TheyarealsocommonlyusedinPetridishesorplates.

Solidmediumisessentialfortheisolationandseparationofbacteriagrowingtogetherinaspecimen.Ifamixtureofbacteriaisspreadacrossthesurfaceofaplatedagarmedium,individualorganismswillmultiplyatindividualsitesuntilavisibleaggregatecalledacolonyforms.Onecolonyof

asinglespeciescanthenbeseparatedfromtherestandtransferredto

anothermedium,whereitwillgrowasapureculture,andcanbestudiedassuch.

Theappearanceofcolonycanbeverydistinctiveforindividualspecies,suchascolor,density,consistency,surfacetexture,shape,andsizeofcolonies.Theycanprovidecluesfortheidentificationofanorganism,althoughfinalidentificationcannotbemadebymorphologyalone.

Inliquidmedium,somebacteriamaygrowdiffusely,producinguniformclouding.Othersmaylookverygranularinbroth.Observationofsuch

featurescanalsobehelpfulinrecognizingtypesoforganisms.

Thereisanotherkindofculturemediumcalledsemisolidmedium.Itisusedtodetectmotilityofbacteria.Non-motilebacteriawillgrowonlyalong

thelineofinoculation,whereasmotilebacteriawillmigratethroughoutthemedium.

Inthisexperiment,youwilllearnhowtomakeaseptictransfersofpurecultureandtoexaminethemforimportantgrossfeatures.

Materials:

1.CultureMediumandBacterialStrains:

CultureMediumBacteriaStrains

PlateamixtureofS.aureus&

E.coli

LiquidMediumE.coli,B.subtitis

SlantE.coli

SemisolidMediumS.dysenteriae,Proteus

2.Inoculatingloop,Inoculatingneedle,Alcohollamp,Matches,Markingpencil.

Methods:

A.LiquidMediumInoculation:

Procedures:

1.Takeuptheloopbythehandleandholditasholdingapencil,loop

down.Putthewireintheflameofthealcohollamp（seeFig.1-1）untilitturnsred.Removetheloopfromtheflameandholdituntilitbecomescool

（Donotputitdownortouchittoanything）.

Fig.1-1Flamingtheloop

2.PickuptheslantcultureofE.coli（orB.Subtilis）withyourlefthand,andusethelittlefingeroftheloophandtoremovethecottonplugoffthe

culturetube.Keepyourlittlefingercurledaroundthiscottonplug.Note:

Don’tplaceitonthetable.

3.Passtheneckoftheopentuberapidlythroughtheflametwoorthreetimes.Thisflamingsterilizestheairinandimmediatelyaroundthemouthofthetube.

4.Inserttheloopintotheopentube（holdingbothhorizontally）.Touchthelooptothegrowthontheslantandremovealoopfulofculture.Note:

Don'

tdigtheloopintotheagar.（seeFig.1-2）

Fig.1-2.Getsomecultureoutofaslant.

Note:

thetubeisheldhorizontally.

5.Withdrawtheloopslowlyandsteadily,beingcarefulnottotouchittothemouthofthetube.Keepitsteadily,anddonottouchanythingwhileyoureplacethetubeclosure.Putthetubebackintherack.

6.Usetheotherhandtopickupatubeofsterilenutrientbroth,removethetubeclosure.Flametheneckofthetube;

inserttheloopintothetubeandintothebroth.Gentlyrubtheloopagainstthewallofthetube.

7.Withdrawtheloop,flamethetubeneck,replacetheclosure,putthe

tubebackintherack.Thencarefullyflametheloop,holdingitfirstinthecoolestpartoftheflame（yellow）,theninthehotblueconeuntilitglows.Whenthewirebecomescool,theloopcanbeplacedonthebenchtop.

8.Labelthetubeyouhavejustinoculatedwithyourname,thenameofthemicroorganism,andthedate.

9.Incubatethetubesovernightat37℃.

B.SlantInoculation:

1.Flametheloop.

2.PickuptheslantcultureofE.coli,openit,flame,andtakesomegrowthwiththesterileloop.

3.Pickupanutrientagarslant.Openandflameitasabove.

4.Introducetheloopintothetube.Streakthesurfaceoftheplatefrombottomtotop.Thenwithdrawtheloopfromthetubewithouttouchingitsinnersurface.

5.Flame,close,andreplacetheinoculatedtubeintherack,thensterilizetheloopasabove.

6.Labelthefreshlyinoculatedtubeandthenincubateitovernightat37℃.

C.SemisolidMediumInoculation:

1.Flametheinoculatingneedle.

2.PickuptheslantcultureofS.dysenteriae（orProteus）,openandflameit,thentakesomegrowthwiththesterileneedle.

3.Pickupatube.Openandflameitasabove.

4.Stabtheneedleintothesemisolidmediumwithouttou