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低温、干燥、缺氧、缺营养物质
(2)方法——
(1)斜面保藏法
(2)沙土管保藏法(3)菌丝速冻保藏法(4)石蜡油封存法(5)冷冻干燥保藏法(6)超低温保藏法
4.工业培养基
主要的培养基成分种类:
⏹碳源:
培养基的主要成分之一,为微生物提供生长繁殖所需的能源,及合成菌体和目的产物的原料。
包括:
1)碳水化合物:
葡萄糖,乳糖,淀粉,糖蜜,糊精,玉米粉等。
2)脂肪:
比糖类释放更多能量,需要更多溶解氧。
3)有机酸,烃和醇类等石油化工产品。
糖蜜——(P101)制糖生产时的结晶母液,是制糖工业的副产品。
糖蜜中含有丰富的糖和氮类化合物,无机盐和维生素等,是微生物发酵培养基价廉物美的碳源。
这种糖蜜主要含有蔗糖,一般分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。
糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生产中,抗生素等微生物工业。
在酒精生产中若用糖蜜代替甘薯粉,可以省去蒸煮,糖化等过程,简化生产工艺。
⏹速效碳源——能够被生物直接利用的含碳化合物,例如葡萄糖是速效,蔗糖就需要先分解成葡萄糖才能被生物利用。
⏹氮源:
构成菌体组分和含氮代谢物,包括:
1)有机氮源:
黄豆饼粉,玉米浆,花生饼粉,蛋白胨,酵母膏,鱼粉,尿素等。
有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外,有的还是产物的前体,如缬氨酸可作为红霉素的前体。
又如玉米浆中的苯乙胺,能大幅提升青霉素G的产量,而加入苯乙酸作为前体则可以增加青霉素V的产量。
2)无机氮源:
铵盐,硝酸盐和氨水等,称为速效氮源,会导致分解代谢物阻遏。
⏹速效,缓效氮源——无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用,这种氮源叫做速效氮源反之为迟效氮源
⏹添加前体:
在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。
⏹葡萄糖效应,对于微生物来说葡萄糖效应有什么意义
葡萄糖效应——又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。
葡萄糖或某些容易利用的基质,其分解代谢产物阻遏另一种异化较难利用基质的酶的合成的效应。
⏹生理酸性物质——无机氮源被菌体作为氮源利用后,培养液中就留下了酸性或碱性物质,这种经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质,如硫酸胺,
⏹生理碱性物质——若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质,如硝酸钠。
工业微生物发酵培养基应具有的特点
1、单位培养基能产生尽量多的产物
2、目的产物的合成速度尽量快
3、副产物尽量少
4、质量稳定,价格低廉,易于长期获得
5、尽量不影响发酵过程中的操作和产物的后处理等
5.发酵体系温度和pH、通气、搅拌的影响因素
影响温度的因素
●生物热:
微生物生长繁殖过程中的产热
●搅拌热:
机械搅拌造成的摩擦热
●蒸发热:
被通气和蒸发水分带走的热量
●辐射热:
发酵罐罐体向外辐射的热量
●显热:
空气流动过程夹带着的热量
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发Q通气-Q辐射
发酵体系pH变化的原因有哪些?
(1)糖代谢特别是快速利用的糖,分解成小分子酸、醇,使pH下降。
糖缺乏,pH上升,是补料的标志之一
(2)氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降;
尿素被分解成NH3,pH上升,NH3利用后pH下降,当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。
(3)生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降
(4).产物形成某些产物本身呈酸性或碱性,使发酵液pH变化。
如有机酸类产生使pH下降,红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性,使pH上升。
(5.)菌体自溶,pH上升,发酵后期,pH上升。
搅拌——搅拌使气泡变小,增大气液相接触面积;
延长气泡在液体中的停留时间;
增加湍动程度,减小气泡外液膜厚度,减小阻力;
使氧气、培养基成分和细胞均匀混合,利于营养物吸收,代谢物扩散。
搅拌比通气速度对KLα的影响更明显。
但搅拌速度过高,会对细胞造成损伤,特别是菌丝,并会增加传热的负担。
通气——
通气速度:
随着通气量的增加,KLα也随之增大,但当通气量大到了一定限度,通入的空气不能被有效打散成小气泡,搅拌器空转,反而造成KLα下降,还会导致蒸发量增大,带走挥发性代谢产物
溶氧异常往往意味着发酵出现问题
1、操作故障或事故2、补料是否恰当
3、是否染菌4、作为代谢方向的指标
6.培养基的灭菌
⏹灭菌:
利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。
⏹消毒:
用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物,一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞。
⏹消毒不一定能达到灭菌的要求,而灭菌则可达到消毒的目的。
灭菌的方法
⏹物理灭菌法
(1)干热灭菌法——微生物细胞发生氧化,微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用,氧化作用导致微生物死亡是主要依据。
由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多,故干热灭菌所需的温度要高,时间要长,一般160~170℃、1~1.5h。
实际应用时,对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。
(2)湿热灭菌法(主要是高压蒸汽灭菌):
利用饱和蒸汽进行灭菌
原理:
借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键,特别是氢键受到破坏,引起不可逆的变性,使微生物死亡。
从灭菌效果来看,由于蒸汽有很强的穿透能力,湿热灭菌对耐热芽胞杆菌来说,温度升高10℃时,灭菌速度常数可增加8~10倍,对营养细胞更高。
另外蒸汽冷凝为水时还要释放出潜热,杀菌效果进一步提高
蒸汽来源方便,价格低廉,灭菌效果可靠
湿热灭菌法是目前最常用的灭菌方法,一般的湿热灭菌条件为121℃,30min
⏹高温杀菌——
1、间接式加热法(板式、管式)——是利用一定压力的水蒸气或热水作为加热介质,热量经过传热壁传递给物料
2、直接混合式加热——是指物料与高温高压蒸汽在一定的压力下混合,蒸汽遇冷,释放潜热将物料迅速加热至杀菌温度。
可分为喷射式、混注式。
喷射式是将高压蒸汽直接喷入到物料中,蒸汽遇冷放热,将物料加热至所需要的温度;
混注式是将物料喷入到充满蒸汽的加压容器中,加热至所需要的温度
✓直接混合加热的方式比间接式加热快的多,但同时会带来什么问题呢?
如何解决呢?
影响加热灭菌的因素——
a)目标含菌量的影响
b)pH值的影响:
pH小于6时,氢离子易于进入胞内,所以pH越小,灭菌效果越好
c)培养基形态的影响:
固体培养基灭菌时间比液体要长。
d)泡沫:
泡沫中的空气形成隔热层,对灭菌十分不利。
⏹火焰灭菌法——利用火焰直接杀死微生物,该方法简单彻底,但适用范围有限,多用于实验室小型金属器具。
⏹辐射灭菌——利用电磁波、紫外线、X射线、γ射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌,以紫外线最常用。
紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用,但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。
紫外线的穿透力低,仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌,对固体物料灭菌不彻底,也不能用于液体物料的灭菌。
250~270nm之间杀菌效率较高。
⏹空气过滤除菌法
(1)绝对过滤——介质之间的孔隙小于被滤除的微生物,当空气流过介质层后,空气中的微生物被滤除。
绝对过滤易于控制过滤后空气质量,操作简便。
采用很细小的介质制成,介质空隙小于0.5um。
(2)介质过滤——介质过滤除菌是目前工业上用的较多的空气除菌方法,它是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物,而取得无菌空气。
常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。
⏹化学灭菌
某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。
化学药剂适用于生产车间环境的灭菌,接种操作前小型器具的灭菌等。
化学药品的灭菌使用方法,根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。
7.泡沫对发酵的影响与控制
.泡沫的控制
⏹调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原料),改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。
⏹采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素。
⏹采用机械消泡和消泡剂来消除已形成的泡沫。
●机械消泡
优点:
节省原料、减少了染菌机会
缺点:
不能从根本上消除引起气泡的原因,不如化学消泡迅速可靠,需设备,耗能。
机械消泡装置的选择依据:
动力小、结构简单、坚固耐用、清洁(杀菌)容易、维修(保养)费用少
机械消泡方法:
罐内消泡:
在发酵罐内消除泡沫,耙式消泡桨、碟式消泡器等
罐外消泡:
将泡沫引出发酵罐外,消泡后再返回罐内,旋转叶片消泡器、离心式消泡器等
消泡剂消泡
化学消泡法
⏹机理:
由于消泡剂本身的表面张力较低,当其与气泡膜表面接触时,使气泡膜局部的表面张力降低,从而使气泡破裂。
⏹消泡剂应有的特点:
是表面活性剂,具有较低的表面张力,一定的亲水性,溶解度较小、无毒,不影响微生物生长,不干扰溶氧,pH值等测定仪表的使用,来源广,价廉。
⏹缺点:
1、消耗多种油类或化工原料;
2、使发酵液中氧的吸收减少1/5-1/3。
工业上常用的消泡剂
⏹天然油脂类——玉米油、豆油、棉籽油、鱼油等
⏹高碳醇类——十八醇、乙二醇聚合物
⏹聚醚类——聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯丙烯甘油
⏹硅酮类——聚二甲基硅氧烷
消泡剂的应用和增效
消泡剂多数是溶解度小、分散性不十分好的高分子化合物,所以在使用时,要考虑如何降低它的黏度和提高它的分散性,来增强它们的消泡效果。
使用的增效方法有:
a)机械分散b)与载体一起使用(载体多为惰性液体)
c)多种消沫剂并用d)利用乳化剂增强消沫剂的消沫作用
消泡剂有选择性。
消泡剂用多了有毒性,而且还影响通气和气体分散,因此要少量地加。
8.初级代谢和次级代谢
初级代谢:
与生物生存有关的,涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。
产物都是有机体生存必不可少的物质,如单糖、核苷酸、脂肪酸,以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。
次级代谢:
是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物本身无明显生理功能,或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。
但有利于生存的代谢类型,通常是在生长后期产生。
产物种类很多,最著名的是抗生素
产生
功能
例子
存在
部位
不同微生物比较
初级代谢产物
不停地合成
生长和繁殖的必需物质
氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素
细胞内
基本相同
次级代谢产物
一定阶段才合成
生长和繁殖的非必需物质
抗生素、毒素、激素、色素
细胞内或外环境中
不相同
次级代谢产物的类型
1,根据产物合成途径区分
根据产物合成途径可以分为五种类型:
(1)与糖代谢有关的类型
(2)与脂肪酸代谢有关的类型
(3)与萜烯和甾体化合物有关的类型
(4)与TCA环有关的类型
(5)与氨基酸代谢有关的类型
2,根据产物的作用区分类型
抗生素、激素、生物碱、毒素、色素及维生素等类型。
次级代谢与初级代谢的关系
1.从代谢方面分析:
许多次级代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的,所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来的,次级代谢途径并不是独立的,而是与初级代谢途径有密切联系的。
某些糖代谢的中间体,即可以来合成初级代谢产物,又可以来合成次级代谢产物,这种中间体叫分叉中间体,如丙二酰CoA。
由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种:
葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其它复合途径。
2.从遗传方面分析:
初级产物和次级产物同样都受到核内DNA的调节控制的。
所不同的是次级代谢产物还受到“与初级代谢产物合成无关的遗传物质”的控制,即受核内遗传物质(染色体遗传物质)和核外遗传物质(质粒)的控制。
有一部分代谢产物的形成,取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径,这类物质称为质粒产物。
当然也有只由染色体DNA控制的抗生素。
因此,两者在遗传上既有相同的部分,又有不同的部分。
初级代谢可以为次级代谢产物合成提供前体物和为次级代谢产物合成提供所需要的能量,而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续和发展。
当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时,初级代谢的终产物过量,往往会抑制次级代谢的合成,这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。
如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体α-氨基己二酸,当培养液中赖氨酸过量时,则抑制α-氨基己二酸的合成,进而影响到青霉素的合成。
9.接种龄以菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期,且培养液中菌体量还未达到最高峰时,较为合适。
结合ppt6P145
10.气升式发酵罐的特点
●反应溶液均匀分布;
●溶氧速率和效率高
●剪切力小:
适于培养剪切力敏感的细胞;
●传热良好,发热量低;
●结构简单,易于加工制造;
●操作维修方便。
11.氧传递方程
.OTR=KLα(C*-CL)
OTR:
单位体积培养液的氧传递速率
KLα:
单位体积传质系数
C*:
溶液中溶氧饱和浓度,mmolO2/L
CL:
溶液主流中的溶氧浓度,mmolO2/L
⏹OTR=KLα(C*-CL)
由氧传递公式可见,凡是能使KLa和C*增加的因素都能使供氧得到提升。
提升的C*的方法:
通入纯氧或富氧,使氧分压提高(成本上升,效率较低)
提高罐压(菌和和设备的承受能力,CO2的影响)
提高通气速率(大气泡造成空转,泡沫问题)
氧的传质系数KLa
需氧微生物反应器的氧传递性能可用体积传质系数表示,其值越大,说明反应器的氧传递性能越好。
因此,提高反应器的氧传递速率,需要增大kLa。
影响KLα的因素
(1)操作条件与变量
温度,通气量与搅拌强度等
(2)发酵液性质
粘度、表面张力、离子浓度、密度、扩散系数等,从而影响到气泡的大小、气泡的稳定性,进而影响氧传递系数KLα
影响体积传质系数KLa的主要因素
发酵液理化性质的影响
发酵过程中营养基质被逐渐消化,但同时菌浓增加,代谢物积累,同时产生泡沫,这些都会对氧传递造成影响,主要是通过改变发酵液的黏度,表面张力,离子浓度等,影响气泡的大小,气泡的稳定性,气泡的数量等,从而影响氧传递速率。
温度对Kla的影响
⏹温度的升高,会降低液体的粘度,减小液体的表面张力,增大氧在液相中的扩散系数
⏹体积传质系数与温度成正比,而与液体粘度成反比。
⏹但同时,温度升高,会导致氧溶解度下降。
OTR=KLα(C*-CL)
盐类对Kla的影响
⏹盐类的影响:
添加多种盐类,反应液的离子强度会增加,会导致体积传质系数值增加,其增加的程度随投入动力的增大而增大,有时为纯水的5~6倍。
这主要原因是在盐类反应液中,气泡群变细小,并且难以合并,另外,气体的滞留量也有增大的倾向。
⏹但同样,离子浓度的增加,会导致氧溶解度的下降。
反应器结构因素的影响
搅拌器:
搅拌器组数和搅拌器直径的最适距离对溶氧有一定的影响。
搅拌器组数和间距在很大程度上要根据发酵液的特性来确定,才能达到较好的溶氧效果。
采用较大的空气流速和较大的搅拌功率时,可有效提高溶氧速率。
但是如果搅拌器之间的位置不当,也会导致流型和空气分布情况发生变化,引起KLa的大幅度下降。
挡板:
带有搅拌装置的反应器都应安装适当的挡板,或以垂直冷排管作为挡板,否则搅拌会使液体形成中心下降的漩涡。
挡板可使液体形成某种轴向运动,不让大量空气通过漩涡外逸,从而提高气液混合效果,改善氧的传递条件
高径比:
当空气流量和单位体积的功率消耗不变时,通气效率随高径比的增大而增大。
经验表明:
高径比由1增大到2时,KLa可增大40%;
由2增大到3时,KLa可增大20%。
因此,发酵工厂倾向于采用较大的高径比。
但是,高径比也不是越大越好,过高会导致罐内液压过大,气泡变小,成本提高。
⏹空气分布管:
⏹管的形式,喷口直径,与罐底的相对位置对于溶氧速率有较大影响。
多采用单管或环管的形式
搅拌的影响
搅拌使气泡变小,增大气液相接触面积;
效率还与罐体积、罐形状、结构、搅拌器形式、挡板有关。
通气的影响
⏹空气在上升过程中也能起到一定的搅拌作用
⏹随着通气量的增加,KLα也随之增大,但当通气量大到了一定限度,通入的空气不能被有效打散成小气泡,搅拌器空转,反而造成KLα下降,还会导致蒸发量增大,带走挥发性代谢产物
其他溶氧控制措施
⏹中间补水、液化培养基、
⏹添加表面活性剂等
⏹溶氧控制的一般策略:
前期大于临溶氧浓度,中后期满足产物的形成
一般认为,发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力,对菌体的生长有时会产生不利的影响,所以有时发酵初期采用小通风,停搅拌,不但有利于降低能耗,而且在工艺上也是必须的。
但是通气增大的时间一定要把握好。
12.试述基因工程菌发酵与传统发酵相比有何区别和特点。
区别:
普通微生物发酵主要收获是它们的初级或次级代谢产物,细胞生长并非主要目标。
基因工程菌培养是为获得最大量基因表达产物。
这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。
蛋白质的合成多在对数期。
在基因工程菌的发酵中,菌体的增殖和产物的表达都是在对数期内完成的,因此,发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌的对数生长时间,缩短衰亡时间
高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要生产工艺
传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同:
传统发酵产品多为小分子,其理化性能,如平衡关系等数据都已知,因此放大比较有根据;
相反,基因工程产品多是大分子,必要数据缺乏,放大多凭经验。
基因工程产品大多处于细胞内,提取前需将细胞破碎,增添了很多困难。
而且发酵液中产物浓度也较稀,杂质又多,加上一般大分子较小分子不稳定(如对剪切力),故提取较困难,常需利用高分辨力的精制方法,如色层分离等。
基因工程产蛋白提取的要求纯度更高,对于安全性的要求更为严格。
基因工程菌不稳定的原因
不稳定的原因:
基因工程菌遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性,还有其表达产物的不稳定性。
1.结构不稳定性:
重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰,降解导致其表观生物学功能的丧失
2.分配不稳定性:
整个重组DNA分子从受体细胞中丢失。
3.质粒的拷贝数的影响:
外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数,在高拷贝数下,结构物质如氨基酸的供应成为限制因素,导致细胞的代谢活力下降,高生长数率时质粒拷贝数下降,但稳定性增加。
4.宿主菌对工程菌的生长优势,对工程菌发酵极为不利。
不稳定的对策:
改进重组质粒的结构、选择适当宿主、控制基因的过量表达、选择合适的拷贝数、调节培养条件、增加外界环境压力、固定化
名词解释
1.包涵体
⏹重组基因工程菌生产蛋白质,其表达形式可以是分泌表达、胞内可溶性表达、胞内不溶性表达。
⏹由外源基因在宿主细胞中表达的不溶性蛋白聚合体称为包涵体。
2.呼吸熵:
RQ值可以反映菌体的代谢情况,例如酵母培养过程:
RQ=1糖代谢走有氧分解代谢途径,仅供生长、无产物形成;
RQ>
1.1走EMP途径,生成乙醇;
RQ=0.93生成柠檬酸;
RQ<
0.7生成的乙醇被当作基质再利用。
1.恒浊法,是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象,用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速,同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出,从而使培养器中的微生物在保持细胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。
用恒浊法连续培养微生物,可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖,达到高效率培养的目的。
2.恒化法,也称连续培养系统,是通过控制培养基中营养物,主要是生长限制因子的浓度,来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。
用于恒化培养的装置称为恒化器。
恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。
因此,它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基因表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术手段多级恒化器的优点是在不同级的罐内存在不同的条件,有利于多种碳源的利用和次级代谢物的生产。
恒浊器与恒化器的比较
装置
控制对象
培养基
培养基流速
生长速率
产物
应用范围
恒浊器
菌体密度(内控制)
无限制生长因子
不恒定
高
大量菌体或与菌体形成相平行的产物
生产为主
恒化器
培养基流速(外控制)
有限制生长因子
恒定
低于最高
不同生长速率的菌体
实验室为主
呼吸强度(P172)——(XX)是植物体新陈代谢强弱的一个重要指标,它是指单位面积或单位重量的植物体,在单位时间内所吸收的氧或释放的二氧化碳量或损失的干重。
如:
每小时每克干重(或鲜重)吸收氧气的毫升数;
或每小时每克干重(或鲜重)放出二氧化碳的毫升数。
呼吸强度单位:
CO2ml·
h·
kg
对于不同种的植物而言,生长快的植物呼吸强度大。
同一植物的不同组织或器官呼吸强度也不同,一般来说,生殖器官强于营养器官,幼嫩器官强于衰老器官,种子内胚强于胚乳。
Monod方程——(P202)(ppt10)存在抑制剂时描述限制性基质浓度影响细胞比生长速度的经验方程。
Monod方程呈双曲线。
µ
m最大比生长速率,
s:
限制性营养物质的浓度,
Ks:
饱和常数,为比生长速度等于最大值的一半时的底物浓度。
其值大,表示微生物对营养物质的吸收亲和力小,反之,
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